Протеин белковый: Белки • Натуральные белковые добавки | iHerb

Белки • Натуральные белковые добавки | iHerb

  • ChocALot

  • Chocolate Chip Mint

  • Chocolate Lava Cake

  • Cocoa Pebbles

  • German Chocolate Cake

  • Mayan Chocolate

  • Баварский шоколад

  • Белый шоколад

  • Богатый шоколад

  • Гладкий шоколад

  • Голландский какао

  • Голландский шоколад

  • Двойной шоколад

  • Двойной шоколад

  • Двойной шоколадный чип

  • Декадентский шоколад

  • Молочный шоколад

  • Молочный шоколад

  • Натуральное какао с шоколадом

  • Натуральный двойной шоколад

  • Натуральный шоколад

  • Протеиновый порошок

  • Расплавленный шоколад

  • Сливочный брауни

  • Сливочный шоколад

  • Сливочный шоколадный выдумка

  • Справедливая торговля Темный шоколад

  • Темный шоколад

  • Тройной шоколад

  • Турбо-шоколад

  • Шоколад

  • Шоколад Fudge Brownie

  • Шоколад Высший

  • Шоколад для гурманов

  • Шоколад и арахисовое масло

  • Шоколад и кокос

  • Шоколад и лесной орех

  • Шоколад и мята

  • Шоколад и солод

  • Шоколадная глазурь

  • Шоколадная мака

  • Шоколадная помадка

  • Шоколадное блаженство

  • Шоколадное молоко

  • Шоколадное мороженое

  • Шоколадное мороженое

  • Шоколадное печенье

  • Шоколадный арахис

  • Шоколадный Домовой

  • Шоколадный какао

  • Шоколадный коктейль

  • Шоколадный крем

  • Шоколадный мокка

  • Шоколадный молочный коктейль

  • Шоколадный торт

  • Шоколадный торт

  • Вред и польза протеина для женщин и мужчин

    Этот полезный белок дает возможность достигать всех поставленных результатов и в принципе очень полезен для любого человека, поскольку содержит ценные аминокислоты, оказывающие положительное влияние на обновление и рост клеток.  Но несмотря на очевидную пользу, имеются и некоторые негативные последствия приема протеиновых добавок, которые возникают, как правило, из-за употребления спортпита низкого качества или ввиду пренебрежения правилами приема протеина. Рассмотрим их подробнее.

    Виды протеинов

    Безусловно, для получения белка можно использовать натуральные источники, например, куриное мясо или рыбу нежирных сортов, говядину, яйца, творог. Однако для тех, кто активно занимается спортом, объем потребляемого белка должен быть намного больше, ввиду чего и приходят на помощь специализированные спортивные смеси.

    Однако для того, чтобы протеиновая смесь работала на вас и помогала в тренировочном процессе, следует правильно подобрать нужный именно вам тип белка. В зависимости от сырья, из которого изготавливают протеин, выделяют следующие виды:

     

    1. Сывороточный протеин: польза и вред этого типа белка полностью зависят от степени его очистки, но в целом, он является хорошо усваиваемой добавкой и отлично подходит для приема сразу после занятий спортом.
    2. Казеиновый протеин (казеин): изготавливается из молока путем створаживания. Делится на мицелярный (более чистый) и казеин кальция.
    3. Молочный протеин: представляет собой соединение сывороточного и казеинового белка. Имеет среднюю усвояемость, в течение 2-х часов после приема.
    4. Мясной протеин: основой является животный белок. Из-за специфического привкуса говядины и высокой цены не пользуется большим спросом.
    5. Соевый протеин: этот белок растительного происхождения самый доступный по цене. Усваивается за пару часов, но не имеет в составе некоторые важные аминокислоты. Увеличивается в размерах при размешивании, что делает его прием удобным. Польза протеина для мужчин сомнительна, поскольку в состав входят женские половые гормоны.
    6. Яичный протеин: производится исключительно из яичных белков, считается идеальным с точки зрения аминокислотного состава.
    7. Комплексный протеин: представляет собой сочетание белковых добавок разной степени усвояемости (казеин, яичный белок, сывороточный изолят), в виду чего подходит как для набора мышечной массы, так и сброса лишних килограммов.

     

    Для того, чтобы протеиновая смесь работала на вас и помогала в тренировочном процессе, следует правильно подобрать нужный именно вам тип белка, исходя из поставленных целей и ваших индивидуальных особенностей.

    В приведенной ниже таблице наглядно продемонстрированы преимущества и недостатки протеинов.

     

    Протеин Преимущества Отрицательные стороны Усвояемость (г/час) Ценность, %
    Сывороточный - можно смешивать с разнообразными компонентами;
    - низкая стоимость;
    - богатый состав;
    - быстро усваивается;
     
    - будет эффективен только до и после тренировки;
    - в течение дня лучше принимать в комплексе с другими белками;
    10-12 100
    Яичный - хороший состав;
    - отлично подходит для похудения;
    - дорогой; 9 100
    Комплексный - состоит из белков разной скорости всасывания;
    - может приниматься как для похудения, так и для набора массы;
    - не всегда качественный состав;
     
    5-8 95
    Молочный - доступная цена;
    - сбалансированный аминокислотный состав;
     
    - в составе присутствуют компоненты, которые могут ухудшать работу ЖКТ; 4-5 90
    Казеин - низкая скорость усвоения;
    - хороший аминокислотный состав;
    - не очень хорошо растворяется в воде;
    - у некоторых производителей имеет не очень приятный вкус;
    4-6 80
    Соевый - понижает уровень холестерина в крови;
    - отлично подходит для женщин;
    - низкоэффективный;
    - содержит в составе фитоэстрогены и ГМО;
     
    4 74

     

    Протеин: польза и вред для женщин и мужчин

    Прием белковых добавок в разумных объемах по специально разработанной схеме окажет на любой организм исключительно положительное влияние. Рассчитывать суточную дозу вещества необходимо с учетом образа жизни человека, его комплекции, процента потери белка за день.


    Спортсмену с большим количеством мышечной массы потребуется гораздо больше белковых добавок, чем хрупкой девушке. Разбираемся более детально.

    1. Польза протеина для женщин

    Польза протеина для девушек и женщин заключается в эффективном похудении и постепенном укреплении мышц. Необходимые организму аминокислоты окажут благоприятное влияние на кожу, волосы, ногти.

    Белковый порошок производят только из натурального сырья. В полученном путем синтеза высококачественном концентрате нет углеводов и жирных кислот.

    Работа над избавлением от лишних килограммов в спортзале в комплексе с употреблением белковых добавок дает отличный результат. В коктейлях, в состав которых входит протеин, польза белка обусловлена его высокой усвояемостью. Несмотря на низкокалорийность напитков, их не рекомендуется употреблять в больших количествах. Без систематических физических нагрузок они могут способствовать набору веса.

    2. Польза протеина для мужчин

    Польза протеина для мужчин безусловна: аминокислоты, которые входят в состав белковых порошков, оказывают на мужской организм самое положительное влияние. Представители сильного пола принимают такие добавки, чтобы быстро увеличить объем мышц и поддерживать организм в тонусе. Помимо этого рациональный прием протеина позволяет нормализовать обменные процессы организма, улучшить выносливость и увеличить силовые показатели при выполнении тренировок.

    Нельзя забывать и о пользе протеина после физических нагрузок – восстановление организма происходит быстрее, притупляется чувство голода.

    Какой вред может нанести прием протеина, как мужчинам, так и женщинам? Если мы говорим об употреблении качественных смесей, произведенных из натурального сырья, то риск возникновения негативного влияния сводится к нулю. Производители, заботящиеся о составе своих протеиновых смесей, выбирают в качестве основы только безопасные продукты, ввиду чего так важно приобретать только сертифицированные спортивные добавки.

    Вреден ли протеин: мнение врачей

    Каждый, кто планирует вводить в свой рацион питания протеиновые добавки, задумывается о том, вреден ли протеин, и какое мнение по этому вопросу высказывают врачи. На сегодняшний день большинство специалистов сходятся во мнении о том, что протеин не может причинить организму вреда. Однако это утверждение справедливо только в том случае, если мы говорим о сертифицированном спортивном питании, так как на рынке все чаще встречаются подделки протеиновых смесей, которых стоит остерегаться. Такой протеин может спровоцировать сбой в работе организма.

    Ко всему прочему, употребление протеина в объемах, превышающих рекомендованную норму, также не скажется лучшим образом: вы не только не улучшите результат тренировок, а наоборот в полной мере ощутите на себе побочные эффекты добавки, среди которых: 

    • разнообразные аллергические реакции;
    • тошнота, вздутие, рвота и другие сбои в пищеварительной системе;
    • появление высыпаний и акне;
    • увеличение веса.

    Употребление качественных белковых коктейлей дозировано приносит организму только пользу:

    • очищается кровь;
    • обменные процессы нормализуются;
    • укрепляется иммунитет;
    • восстанавливается гормональный фон;
    • улучшается работа мозга.

    Поэтому так важно проконсультироваться со специалистами, которые подберут наиболее подходящий тип протеиновых смесей в соответствии с вашими индивидуальными особенностями и поставленными задачами. Также обязательно следует выявить возможные противопоказания, ведь прием протеина запрещен при хронических заболеваниях почек и ЖКТ, а также непереносимости любого компонента такой спортивной смеси.

    Рекомендации экспертов Prime Kraft

    Эксперты компании PRIME KRAFT, специализирующейся на выпуске спортивного питания, особо отмечают, что комплексные протеиновые смеси станут вашим отличным помощником лишь в том случае, если вы совместите их прием с регулярной физической нагрузкой и правильным рационом питания.  

    На увеличение объема мышечной массы оказывают влияние незаменимые для организма аминокислоты, которые содержатся в протеине. Также эти органические соединения способствуют формированию определенных гормонов, ускоряют правильный рост костных тканей, являются источником энергии.

    Протеиновые смеси, предлагаемые в нашем каталоге, проходят строгий контроль качества на всех этапах производства и создаются в соответствии со всеми утвержденными стандартами. Безусловно, помимо качественной стороны, следует уделять внимание и количеству потребляемого протеина. В одной из наших прошлых статей мы подробно рассказали о том, как правильно пить протеин и в какое время это лучше делать, чтобы добиться желаемого результата.

    По промокоду BLOG в официальном интернет-магазине primekraft.ru скидка на весь ассортимент 10%! Доставка по всей России.

    Не забывайте о правилах безопасности для того, чтобы исключить развитие негативных последствий и вреда от приема протеиновых смесей – следуйте инструкции на этикетке, а также рекомендациям специалистов по спортивному питанию.

    Протеин на ночь I В чем польза? I Стоит ли принимать?

    Last Updated: 14/02/2021

    Многие из нас в детстве пили стакан молока перед сном, как нам объясняли, для крепких костей. Однако знаете ли вы, что этот напиток, выпитый на ночь, может быть также полезен для улучшения результатов ваших тренировок, для повышения спортивной производительности? В этой статье мы предоставим вам доказательства этого утверждения и поделимся некоторыми практическими рекомендациями, которые помогут вам избежать любых потенциальных ловушек.

    В этой статье будут рассмотрены следующие вопросы:

    Преимущества потребления протеина перед сном


    Потеря веса


    Протеин является основным питательным веществом, которое стимулирует рост новой мышечной ткани, а также помогает в период снижения веса поддержать построенную путем усиленных тренировок мышечную массу.10 Однако польза протеина этим не ограничивается — исследования показывают, что потребление белка до отхода ко сну может ускорить обмен веществ и помочь преодолеть чувство голода. Это важно, ведь чтобы похудеть, мы должны сжигать больше калорий, чем потребляем в течение дня.

    Удивительно, но исследования показали, что потребление белка перед сном приводит к ускорению метаболизма на следующий день, то есть вы сожжете приблизительно сто дополнительных калорий просто благодаря тому, что выпили накануне вечером перед сном белковый коктейль.8,9,11

    Кроме того, организм использует гораздо больше энергии для переваривания и усвоения белков, чем для переваривания углеводов. Это значит, что ночной протеиновый перекус может также ускорить обмен веществ во время сна.1 И наконец, после потребления белка мы будем чувствовать себя сытыми, благодаря чему нам удастся не поддаться соблазну поздно вечером и воздержаться от калорийных закусок, которые могут отдалить нас от нашей цели — желаемого веса.2

    Сегодня все еще не совсем ясно, является ли для ускорения метаболизма какой-то определенный вид протеина лучше других, но большинство современных исследований приходит к выводу, что больше может означать лучше, если учесть, что 48 г максимально увеличивают расход энергии в покое по сравнению с 24 г (т.е. две порции эффективнее, чем одна).8

    Влияние на рост мышц


    Учитывая что большинство людей тренируется по вечерам и потребляет протеин после тренировки, скорее всего немногие из них выпивают протеиновые коктейли перед сном. Это особенно важно, учитывая, что обычно во время сна стимуляция роста мышц низкая, поэтому в течение ночи вы можете подвергаться риску распада мышечного белка.3,15

    К счастью, исследователи доказали, что в течение ночи кишечник продолжает нормально функционировать, а это означает, что вы можете переваривать любой белок, принятый перед сном.5 Если перед сном вы выпьете белковый коктейль, пока вы спите, протеин будет стимулировать мышечный рост.

    Так сколько протеина нужно принимать? Исследования показали, что 40 г казеина перед сном стимулирует синтез мышечного белка примерно на 20%.12

    Таким образом создаются благоприятные условия для роста мышц, поскольку наши мышцы из состояния отрицательного белкового баланса переходят в положительное. Исследования также показали, что протеиновый коктейль перед сном в сочетании с регулярными тренировками приводит к изменениям в размерах и силе мышц.14

    Например, те, кто регулярно потреблял протеиновые коктейли перед сном, увеличили показатель своего рабочего максимума (в шести различных упражнениях) до 150 кг, что на 30 кг больше показателя тех, кто перед сном не употреблял протеин. Результаты также выразились в увеличении размера четырехглавой мышцы до 10% и увеличении числа «быстрых» мышечных волокон II типа на 12%. Эти волокна могут генерировать большую силу, и на них можно положиться при поднятии весов.

    Влияние на сон


    Сон считается важным условием для восстановления, и постоянное недосыпание может снизить работоспособность, ослабить иммунитет и синтез белка.6

    Хотя в этой области и требуется проведение гораздо большего количества исследований, на сегодняшний день нам известно, что диета с высоким содержанием белка может улучшить общее качество сна.7 Кроме того, потребление белка перед сном может увеличить количество аминокислоты L-триптофана. Если потребляять триптофан с углеводами,  увеличивается его поглощение мозгом, что помогает сократить время засыпания, а также улучшить общее качество сна.6

    Какой вид протеина лучше принимать на ночь?


    На сегодняшний день результаты большинства научных исследований поддерживают применение казеинового протеина, хотя различия между казеином, сывороточным и соевым очень малы. Теория, лежащая в основе преимущественного использования казеина, заключается в том, что он обеспечивает более длительное высвобождение аминокислот и, таким образом, поддерживает доступность аминокислот в течение всей ночи.4

    Кроме того, казеин, по-видимому, оказывает более выраженное влияние на ускорение метаболизма на следующий день и, по-видимому, обладает большей способностью насыщать — после его приема ощущается чувство сытости.1

    И все же, для того, чтобы уверенно утверждать о преимуществах того или иного вида протеина при приеме на ночь, необходимо проведение дополнительных исследований. Хотя необходимо учесть, что в большинстве исследований, перечисленных выше, были изучены дозы от 40 до 50 граммов, что может являться более важным критерием, чем выбор определенного вида протеина.

    Протеиновые порошки от Myprotein


    Смесь для ночного восстановления



    Содержание белка в одной порции: 45 г

    Смесь для ночного восстановления — это протеиновый порошок с медленным высвобождением ингредиентов, который включает четыре различных белков: сывороточный, мицеллярный казеин, молочный изолят и протеин из яичного белка. Есть данные, свидетельствующие о том, что лучший эффект на синтез мышечного протеина может оказывать сочетание сыворотки с казеином, поскольку сыворотка помогает быстро поднять концентрацию протеина, а казеин — продлить во времени его поступление в организм.16

    Благодаря такому сочетанию ингредиентов протеиновые смеси становятся хорошим решением для приема перед сном. Еще одним преимуществом этого продукта является наличие в составе цинка и магния, которые, как показали результаты исследований, могут улучшить качество сна и восстановление после тренировок.17,18

    Протеиномания: действительно ли нашему организму необходимо столько белков

    • Джессика Браун
    • BBC Future

    Многие из нас сознательно выбирают диету, богатую белками, а магазины с радостью предлагают продукты с высоким их содержанием. Сколько белков нам на самом деле нужно? И помогают ли они избавиться от лишнего веса?

    Автор фото, Getty Images

    В начале ХХ века исследователь Арктики Уильялмур Стефанссон в течение пяти лет ел только мясо. Соответственно, его рацион состоял примерно на 80% из жиров и на 20% из белков.

    Двадцать лет спустя, в 1928 году, он повторил эксперимент под наблюдением специалистов из госпиталя Беллевю в Нью-Йорке, но ограничился одним годом.

    Стефанссон хотел опровергнуть мнение, что человек не выживет на одном только мясе. Но, к несчастью, в обоих экспериментах ему быстро становилось плохо, если он некоторое время потреблял только нежирное мясо.

    У него наблюдалось "белковое отравление", которое также прозвали "голоданием на крольчатине". Симптомы исчезали, когда он менял рацион: начинал есть меньше белков и больше жиров.

    Для просмотра этого контента вам надо включить JavaScript или использовать другой браузер

    Підпис до відео,

    Супер-еда для волос и ногтей

    После этих экспериментов, живя в Нью-Йорке и потребляя типичный американский рацион со средним содержанием белков, Стефанссон начал жаловаться на ухудшение здоровья.

    Он вернулся к своей диете - с ограничением углеводов и высоким содержанием жиров и белков - и прожил на ней до 83 лет.

    Его первые эксперименты - одни из немногих формальных научных доказательств того, что высокобелковая диета может быть очень вредной.

    Несмотря на большую популярность протеиновых пищевых добавок, многие из нас до сих пор не уверены, сколько белков нам нужно, как их лучше потреблять и чем грозит их дефицит или избыток в организме.

    Хотя за последние двадцать лет уровень ожирения среди британцев вырос вдвое, многие, наоборот, выбирают сознательный подход к питанию. Мы заменяем белый хлеб черным и цельнозерновым, а обычное молоко - обезжиренным.

    Центральную роль в моде на здоровый образ жизни играют белки; полки супермаркетов пестрят протеиновыми батончиками, протеиновыми шариками и повседневными продуктами, обогащенными белками, от зерновых хлопьев до супов.

    В 2016 году объем глобального рынка протеиновых пищевых добавок составлял примерно 12,4 млрд долларов. Очевидно, нас убедили, что чем больше белков - тем лучше.

    Автор фото, Getty Images

    Підпис до фото,

    Производители протеиновых добавок советуют выпивать после тренировки протеиновый коктейль, чтобы мышечные ткани восстанавливались и росли

    Впрочем, некоторые эксперты сейчас заявляют, что покупать продукты с повышенным содержанием белков (по не менее повышенной цене) - это выбрасывать деньги на ветер.

    Белки необходимы для роста и восстановления клеток тела. Белковая пища, такая как мясо, рыба, яйца, молочные продукты и бобовые, в желудке расщепляется на аминокислоты и поглощается тонким кишечником; потом печень решает, какие из аминокислот нужные организму. Остальные вымываются с мочой.

    Взрослым, чей образ жизни не особо активен, советуют ежедневно потреблять примерно 0,75 г белков на килограмм массы тела. В среднем, это 55 г для мужчин и 45 г для женщин. Их можно получить из двух порций (размером в ладонь) таких продуктов как мясо, рыба, тофу, орехи или бобовые.

    Если белков недостаточно, у человека могут выпадать волосы, появляться сыпь на коже или снижаться вес из-за потери мышечной массы. Но такие побочные эффекты встречаются очень редко, в основном у тех, кто страдает от пищевых расстройств.

    Большинство из нас ассоциирует белки с развитием мышц. Так и есть. Силовые упражнения приводят к расщеплению белков в мышцах. Чтобы мышцы крепли, белки должны возобновляться. Особенно большую роль в запуске процессов синтеза белков играет аминокислота под названием лейцин.

    Некоторые специалисты даже считают, что, если не поесть после тренировки белковой пищи или добавок, мышцы будут разрушаться или плохо возобновляться, то есть не вырастут. Производители добавок советуют выпивать после тренировки протеиновый коктейль - обычно на основе богатого лейцином сывороточного белка, побочного продукта производства сыра.

    Автор фото, Getty Images

    Підпис до фото,

    Многие потребляют продукты спортивного питания, например, протеиновые батончики и коктейли

    Потребители преимущественно соглашаются. Согласно отчету, опубликованному в 2017 году исследовательской компанией Mintel, 27% британцев потребляют продукты спортивного питания, такие как протеиновые батончики и коктейли. Эта цифра возрастает до 39% среди тех, кто тренируется чаще одного раза в неделю.

    Но более половины (63%) из тех, кто потребляет упомянутые продукты, не могут точно сказать, есть ли от них польза.

    Исследование того, насколько протеиновые добавки помогают нарастить мышцы, показывают неоднозначные результаты.

    В частности, в 2014 году ученые проанализировали 36 научных статей на эту тему и пришли к выводу: протеиновые добавки не влияют на нежировую массу тела и силу мышц в течение первых нескольких недель силовых тренировок у людей, которые ранее не занимались спортом.

    Со временем, когда тренировки становятся интенсивнее, добавки действительно могут способствовать наращиванию мышц. Однако авторы также отмечают, что эти изменения не исследовались в долгосрочной перспективе.

    Другое исследование за 2012 год говорит, что протеин "улучшает результативность тренировок, способствует восстановлению и увеличивает нежировых массу тела", но добавляет: для лучших результатов, белки следует потреблять вместе с быстрыми углеводами.

    И если спортсменам и посетителям тренажерных залов полезно быстрое "вливание" белков в организм сразу после тренировки, это не значит, что обязательно употреблять добавки и коктейли.

    Большинство людей уже и так получают большую часть рекомендованного дневного количества белков из обычной пищи, говорит Кевин Типтон, преподаватель физической культуры из Университета Стерлинга.

    "В добавках нет необходимости. Это удобный способ получить протеин, но в них нет ничего такого, чего не получишь из обычной еды. Протеиновые батончики - это обычные сладкие батончики с несколько большим содержанием белков".

    Автор фото, Getty Images

    Підпис до фото,

    В 2016 году объем всемирного рынка протеиновых пищевых добавок составлял 12,4 долларов

    Типтон добавляет, что даже для культуристов сывороточный белок и другие подобные вещества не столь важны, как это нам подают. "Внимание слишком смещено на то, какие добавки употреблять, но на самом деле важнее идти в зал и работать. Важное значение имеют также другие переменные, такие как сон, диета и уровень стресса", - говорит он.

    Большинство экспертов согласны с Типтоном: белки лучше получать из пищи, а не из добавок. Но есть определенные исключения - в частности, спортсмены, которым трудно достигать ежедневной цели в потреблении белков, отмечает Грэм Клоуз, профессор физиологии Ливерпульского университета имени Джона Мурса.

    "По моему мнению, потребности большинства из них превышают рекомендованную дневную норму, и этому есть доказательства", - говорит он. В таком случае, коктейль может быть полезным.

    Какой еще демографической группе не помешают дополнительные белки? Пожилым людям. Потому что с возрастом мы нуждаемся в большем количестве белков для поддержания той же мышечной массы. В то же время пожилые люди склонны потреблять меньше белков, потому что их вкусы часто меняются в сторону расположения к сладкому.

    Автор фото, Unsplash

    Підпис до фото,

    Большинство людей получает больше рекомендованного дневного количества белка из своего обычного рациона

    Эмма Стивенсон, профессор физической культуры с Ньюкаслского университета, пытается договориться с производителями продуктов питания о повышении содержания белков в изделиях, которые часто покупают пожилые люди, например, в печеньи. "С возрастом нам нужно особенно тщательно сохранять свою мышечную массу, ведь мы становимся слабыми и менее активными", - говорит она.

    Клоуз утверждает, что пожилые люди должны повысить потребление белков до 1,2 г на килограмм массы тела.

    К счастью, употребить слишком много белков очень сложно. Хотя верхний лимит существует, его "практически невозможно" достичь, считает Типтон. "Некоторые диетологи обеспокоены, что высокобелковая диета может навредить почкам и костям, но доказательств тому очень мало, если речь идет о вполне здоровых людях.

    Возможно, проблемы и возникнут, если человек с больными почками будет есть большое количество белков; но любые плохие последствия очень маловероятны".

    Впрочем, хотя белки сами по себе не вредны, белковые добавки часто содержат значительное количество углеводов из группы FODMAP, а те в свою очередь вызывают расстройства пищеварения: вздутие живота, метеоризм, боль в желудке.

    Стивенсон советует внимательно читать информацию на этикетках пищевых добавок, батончиков и шариков. "Часто они очень калорийны и содержат огромное количество углеводов, нередко в форме сахара. Не следует думать, что "высокое содержание протеина" автоматически означает здоровую пищу", - говорит она.

    Похудение

    Белки давно связывают с похудением; высокобелковые и низкоуглеводные диеты (например, палеодиета или диета Аткинса) обещают продлить ощущение сытости.

    Людям часто не удается похудеть, потому что они чувствуют голод и едят. Как показали исследования с использованием МРТ, высокобелковый завтрак способствует уменьшению аппетита в течение дня.

    Есть достаточно доказательств того, что белки хорошо утоляют голод, говорит Александра Джонстоун с Абердинского университета. Если вы пытаетесь похудеть, то важнее есть высокобелковые завтраки, такие как тост с фасолью или молочный коктейль, чем принимать добавки.

    Но она не защищает диеты Аткинса и обнаружила в своем исследовании, что исключение из рациона углеводов негативно сказывается на здоровье кишечника (а мы знаем, что здоровый кишечник критически важен для многих аспектов нашего здоровья и благополучия).

    Автор фото, Getty Images

    Підпис до фото,

    Протеиновые шарики часто высококалорийны и содержат огромное количество углеводов

    Зато Александра Джонстоун рекомендует людям с избыточным весом поддерживать рацион, богатый белками и умеренно богатый углеводами: 30% белков, 40% углеводов и 30% жиров.

    Для сравнения, людям без лишнего веса рекомендуют потреблять в среднем 15% белков, 55% углеводов и 30% жиров.

    Конечно же, вы не похудеете, если только увеличите потребление белков. Важный ключ к успеху - есть курятину, другое нежирное мясо или рыбу. Исследования также показывают, что потребление большого количества животных белков способствует набору веса, а красное мясо повышает риск рака и сердечных заболеваний.

    Однако существуют полезные белки не мясного происхождения, например, микопротеин - растительный белок, который получают из грибов. На его основе в Британии выпустили заменитель мяса под маркой Quorn - в нем много не только белков, но и клетчатки.

    Сейчас исследователи изучают, как эта уникальная комбинация белков и клетчатки влияет на ощущение сытости и уровень инсулина, связанный с диабетом второго типа.

    Одна исследовательская группа сравнила микопротеиновую диету с диетой на основе курятины и установила: у тех, кто ел Quorn, контроль над сахаром был такой же, но при этом от поджелудочной железы требовалось производить меньше инсулина.

    Риск употребить избыточное количество белков небольшой, но существенный риск - обольщаться продуктами с завышенной ценой, которые предлагают нам больше белков, чем нам нужно.

    "Некоторые продукты, обозначенные как "высокобелковые", на самом деле таковыми не являются, а стоят они довольно дорого.

    Как бы там ни было, потреблять больше белков, чем вам нужно, - это расточительство. Это все равно, что спускать деньги в унитаз", - говорит Джонстоун.

    Прочитать оригинал этой статьи на английском языке вы можете на сайте BBC Future.

    Выбираем качественный и эффективный протеин. Разбор по составу

    9 факторов, которые нужно учитывать при выборе протеина

    1. Происхождение белка

    Основные источники белка для изготовления протеинов:

    • молочного происхождения,
    • белок яиц,
    • мясные продукты,
    • растительный белок (горох, соя и т.д.).

    Каждый белок имеет свои полезные свойства и биологическую ценность, а также закрывает определенные потребности организма.

    2. Два вида протеиновых коктейлей: в чем разница?

    Сегодня в продаже можно встретить два типа протеина:

    •  Монопротеин – белок одного типа. Моментально усваивается организмом, стремительно обогащает ткани мышц аминокислотами. Такой коктейль лучше употреблять непосредственно перед тренировкой или сразу после нее, а также утром после сна.

    3. Формы сывороточного протеина – важна степень очистки

    Существует несколько видов сывороточного протеина, которые отличаются друг от друга степенью фильтрации.

    Получается на начальном этапе фильтрации сывороточного протеина, в нем остается некоторое количество жиров и лактозы. Концентрат содержит от 60 до 80% белка. Главное достоинство — низкая стоимость.

    4. Аминокислотный профиль продукта

    Ценность протеинового коктейля определяется тем, в каком количестве и соотношении в нем содержатся аминокислоты.

    Ключевые из них – лейцин, изолейцин и валин. Это так называемые ВСАА – кислоты с разветвленной цепью. Во время тренировок BCAA подвергаются повышенному окислению, продукты их обмена улучшают синтез мышечного белка, уменьшают повреждения тканей и увеличивают энергию организма.

    5. Безопасность протеина

    • Лабораторная экспертиза. В первую очередь продукт должен пройти проверку в лаборатории и получить заключение экспертов. Оценка продукта должна проводиться по следующим параметрам: безопасность, биологическая ценность белка, соответствие показателей пищевой ценности указанным в маркировке, 
      органолептические свойства.

    6. Вкус продукта  

    Это существенная характеристика, от которой зависит, будете ли вы употреблять протеин с удовольствием или через силу. Белковые коктейли могут иметь вкус мороженного, клубники и даже содержать в себе кусочками ягод.

    Если после употребления протеина остается химическое послевкусие, возможно в него добавлены синтетические компоненты, и вам стоит задуматься о натуральности такого продукта и его пользе.

    7. Упаковка протеина: имеет значение

    8. Дополнительные ингредиенты в составе

    Также для увеличения полезных свойств продукции иногда белковые коктейли обогащают антиоксидантами и натуральными компонентами, которые:

    • ускоряют метаболизм,
    • стимулируют активное жиросжигания и формирование красивого рельефа,
    • усиливают восприимчивость организма к питательным веществам. 

    9. Протеин женский и мужской: каждому свое

    Сколько белка вам нужно употреблять ежедневно?

    Поделиться с друзьями

    Подписка

    Подпишитесь на полезные статьи

    Каждую неделю мы рассказываем о новых сравнительных тестах продуктов
    питания и бытовой техники. Коротко и по делу.

    Сравниванием сывороточный и растительный протеин – 4fresh блог

    Растительные белки дают более здоровый профиль, с хорошим витаминно-минеральным составом, соотношением белков, углеводов, жиров и клетчатки.

    Преимущества растительного белка

    Статистика подтверждает, что люди, потребляющие больше растительного белка, имеют преимущества в следующих показателях:

    1. Низкие показатели заболеваемости диабетом
    2. Меньше случаев болезни сердца
    3. Сниженный риск развития рака

    Также, растительные диеты имеют ряд положительных экологических эффектов:

    • Производство одного грамма мяса требует в 26 раз больше ископаемого топлива, земли и воды, чем производство одного грамма соевого белка.
    • Употребление большого количества растений и меньшего количества животных может помочь сократить выбросы парниковых газов (из-за меньшего количества ферм) и сократить разрушение естественных мест обитания животных, т.к. пространство очищается для сельскохозяйственных угодий.

    Что же выбрать?

    Есть сторонники как растительного, так и сывороточного белка. Оба вида протеина помогают питать организм и поддерживать его работу должным образом. Сывороточный белок уже давно завоевал любовь не только профессиональных спортсменов, но и просто людей, ведущих активный образ жизни. Его можно найти везде, где только можно.

    Растительный белок долгое время не воспринимали, как достойную альтернативу в области фитнеса и бодибилдинга, однако, за последние годы было завершено несколько исследований по этому вопросу, что говорит о растущем интересе к переходу именно на этот вид белка.

    Все больше и больше людей переключаются на вегетарианские диеты, будь то для здоровья, сохранения окружающей среды или этичности.

    Узнав о некоторых преимуществах растительного белка, возможно, сократить количество животного белка покажется вам хорошей идеей.

    Основные задачи при выборе протеина:

    1. Привести свой организм в отличную форму и иметь превосходное самочувствие. Чтобы тело было активным, здоровым и красивым, нужно найти правильный диетический баланс.
    2. Поддержать здоровье, разнообразить рацион — лучше растительными видами белка.
    3. Сохранять положительный протеиновый баланс после выполнения тяжелых тренировок – с этой задачей отлично справится сывороточный протеин.

    А теперь разберемся, когда и какой протеин лучше всего употреблять, и какие у тех или иных видов преимущества.

    Тип протеина Лучшее время приема Основные преимущества
    Сывороточный Утром натощак, перед тренировкой, после тренировки Богат аминокислотами ВСАА, быстро усваивается, увеличивает синтез белка
    Комплексный (смесь разных видов протеина) Перед сном, между приемами пищи Богат аминокислотами ВСАА, быстро и постепенно усваивается
    Яичный Утром натощак, перед тренировкой, после тренировки Быстро усваивается, богат антиоксидантами
    Соевый Утром натощак, перед тренировкой, после тренировки Богат глутамином и аргинином, быстро усваивается, имеет антиоксидантные свойства
    Конопляный Перед сном, между приемами пищи Положительно влияет на здоровье, богат аминокислотами ВСАА, аргинином и ПНЖК, богат клетчаткой
    Гороховый Перед сном, между приемами пищи Полностью усваивается, богат клетчаткой
    Рисовый Перед сном, между приемами пищи Полностью усваивается, богат клетчаткой, богат витаминами группы В и сложными углеводами
    Миндальный В качестве перекуса в течение дня, в составе выпечки или напитков Богат клетчаткой, железом, кальцием, и цинком. Имеет в составе жиры и углеводы
    Тыквенный В качестве перекуса в течение дня, в составе выпечки или напитков Богат клетчаткой, содержит витамин E, цинк, магний, марганец и фосфор
    Протеин семян Чиа В качестве перекуса в течение дня, в составе смузи, завтраков и йогуртов. Богат клетчаткой, кальцием и антиоксидантами

    Итак, вопреки распространенному мнению, растительные виды протеина имеют полноценный аминокислотный состав, а также ряд преимуществ в виде достаточного количества клетчатки и витаминов.

    И если сывороточный белок является отличным помощником при активных тренировках и наращивании мышечной массы, то растительный станет прекрасным обогащением рациона абсолютно любого человека — причем не обязательно придерживающегося вегетарианской диеты.

    Автор: Светлана Шведов

    польза для здоровья, похудения и наращивания мышц

    Протеины — это научное название белков, которые являются основным строительным материалом в организме. Кроме того, к их числу относятся антитела, защищающие человека от инфицирования, и гемоглобин, крайне необходимый спортсменам.

    Недостаток протеинов может стать причиной таких проблем, как увеличение массы тела, ухудшение состояния кожи, волос.

    Что такое протеиновый коктейль?

    Получить достаточное количество протеинов, включая в рацион «обычные» продукты – достаточно сложная задача. Особенно трудно приходится людям, которые много работают, так как они не имеют достаточно времени для того, чтобы организовать правильное питание. 

    Внимание! Тем, кто борется с лишним весом или стремится к высоким спортивным достижениям, рекомендуется употреблять протеиновые коктейли.


    Их основой является вытяжка из водорастворимых натуральных белков, для получения которых используются соевые бобы, молочная сыворотка или яичный белок.

    Протеиновые коктейли обладают низкой калорийностью. Усваиваясь, они не приводят к увеличению жировой прослойки и ускоряют метаболизм. Это позволяет рекомендовать подобные напитки желающим избавиться от лишних килограммов.

    Польза протеиновых коктейлей для здоровья и похудения

    Это готовые продукты, которые даже в офисе помогут быстро и надолго утолить голод. Они прекрасно усваиваются организмом и не нарушают функцию желудочно-кишечного тракта. 

    Сегодня диетологи рекомендуют женщинам, желающим иметь стройное и подтянутое тело, регулярно употреблять протеиновый напиток. Такие коктейли помогают также:
    • укрепить иммунитет; 
    • нормализовать гормональный фон; 
    • улучшить работоспособность пищеварительной системы. 

    С целью снижения веса диетологи рекомендуют дважды в день заменять стандартный прием пищи порцией белкового напитка. После его употребления человек долгое время не ощущает чувства голода. При этом его организм не страдает от недостатка питательных веществ, как это бывает, когда женщины «сидят» на некоторых видах диет. Он получает достаточный заряд энергии, поэтому сохраняет отличную работоспособность.

    Внимание! У людей, худеющих с помощью белковых напитков, не наблюдается ухудшение настроения из-за постоянных мыслей о еде. Кроме того, протеиновый коктейль можно взять с собой на прогулку или на пикник, так как он может храниться в термосе до трех часов.

    Польза протеинов для спортсменов


    В сочетании с интенсивными занятиями в спортзале, белковый коктейль способствует формированию рельефа тела. С этой целью его рекомендуется принимать до и после тренировки. 

    Одна порция коктейля, выпитая перед посещением спортзала, помогает организму получить количество белка, требующееся для наращивания мышечной массы. Еще один стакан напитка принимается после тренировки для восстановления сил и получения заряда энергии на целый день.

    Вред протеиновых коктейлей

    Опасения по поводу протеиновых продуктов, как правило, связаны с тем, что многие просто не владеют информацией об их составе и свойствах. В частности, можно услышать мнения, что протеин может оказать отрицательное воздействие на почки и печень. 

    Спешим развеять подобные сомнения. Существуют результаты серьезных научных исследований, показывающие, что белок в чистом виде наоборот способствует нормальной работе органов и систем организма человека. 

    Исключение составляют ситуации, когда люди имеют индивидуальную непереносимость белка. Однако они составляют достаточно малочисленную группу.

    Обзор анализа белок-белкового взаимодействия | Thermo Fisher Scientific

    Белки контролируют все биологические системы в клетке, и хотя многие белки выполняют свои функции независимо, подавляющее большинство белков взаимодействуют с другими для обеспечения надлежащей биологической активности. Характеристика межбелковых взаимодействий с помощью таких методов, как коиммунопреципитация (ко-IP), анализ методом «pull-down», перекрестное связывание, перенос метки и дальневестерн-блот-анализ имеет решающее значение для понимания функции белка и биологии клетки.

    Посмотреть все продукты для анализа взаимодействия белков


    Введение в белок-белковые взаимодействия

    Белки - это рабочие лошадки, которые способствуют большинству биологических процессов в клетке, включая экспрессию генов, рост клеток, пролиферацию, поглощение питательных веществ, морфологию, подвижность, межклеточную коммуникацию и апоптоз.Но клетки реагируют на множество стимулов, и поэтому экспрессия белка - это динамический процесс; белки, которые используются для выполнения определенных задач, не всегда могут быть экспрессированы или активированы. Кроме того, не все клетки равны, и многие белки экспрессируются в зависимости от типа клетки. Эти основные характеристики белков предполагают сложность, которую может быть трудно исследовать, особенно при попытке понять функцию белка в надлежащем биологическом контексте.

    Критические аспекты, необходимые для понимания функции белка, включают:

    • Последовательность и структура белка - используется для обнаружения мотивов, которые предсказывают функцию белка
    • История эволюции и консервативные последовательности - идентифицирует ключевые регуляторные остатки
    • Профиль экспрессии - выявляет специфичность клеточного типа и то, как регулируется экспрессия
    • Посттрансляционные модификации - фосфорилирование, ацилирование, гликозилирование и убиквитинирование предполагают локализацию, активацию и / или функцию
    • Взаимодействие с другими белками - функция может быть экстраполирована, зная функцию партнеров по связыванию
    • Внутриклеточная локализация - может указывать на функцию белка

    До конца 1990-х годов анализ функции белков в основном фокусировался на отдельных белках.Однако, поскольку большинство белков взаимодействуют с другими белками для правильного функционирования, их следует изучать в контексте их взаимодействующих партнеров, чтобы полностью понять их функцию. С публикацией генома человека и развитием области протеомики понимание того, как белки взаимодействуют друг с другом и идентификация биологических сетей, стало жизненно важным для понимания того, как белки функционируют в клетке.

    Справочник по приготовлению белков

    Узнайте больше о том, как обессоливать, заменять буфер, концентрировать и / или удалять загрязняющие вещества из образцов белка, иммунопреципитации и других методах очистки и очистки белков с помощью различных инструментов биологии белков Thermo Scientific в этом 32-страничном справочнике.

    • Иммунопреципитация (IP), co-IP и хроматин-IP
    • Теги очистки рекомбинантного белка
    • Безопасный диализ образцов белка с помощью диализных кассет и устройств Slide-A-Lyzer
    • Быстрое обессоливание образцов с высоким извлечением белка с использованием спиновых обессоливающих колонн и пластин Zeba
    • Эффективное удаление определенных загрязняющих веществ с помощью смол, оптимизированных для удаления моющих средств или эндотоксинов
    • Концентрируйте разбавленные образцы белка быстро с помощью концентраторов белка Pierce

    Типы белок-белковых взаимодействий

    Белковые взаимодействия принципиально характеризуются как стабильные или временные, и оба типа взаимодействия могут быть как сильными, так и слабыми.Стабильные взаимодействия связаны с белками, очищенными как мульти-субъединичные комплексы, и субъединицы этих комплексов могут быть идентичными или разными. Гемоглобин и ядерная РНК-полимераза являются примерами мульти-субъединичных взаимодействий, которые образуют стабильные комплексы.

    Ожидается, что временные взаимодействия будут контролировать большинство клеточных процессов. Как следует из названия, временные взаимодействия носят временный характер и обычно требуют набора условий, которые способствуют взаимодействию, таких как фосфорилирование, конформационные изменения или локализация в дискретных областях клетки.Временные взаимодействия могут быть сильными или слабыми, быстрыми или медленными. Находясь в контакте со своими партнерами по связыванию, временно взаимодействующие белки участвуют в широком спектре клеточных процессов, включая модификацию белков, транспорт, фолдинг, передачу сигналов, апоптоз и клеточный цикл. В следующем примере проиллюстрированы белковые взаимодействия, которые регулируют апоптотические и антиапоптотические процессы.


    Тяжелое белок-белковое взаимодействие BAD. Панель A: окрашенный кумасси гель SDS-PAGE рекомбинантного легкого и тяжелого BAD-GST-HA-6xHIS, очищенный из лизатов HeLa IVT (L) с использованием тандемного сродства глутатионовой смолы (E1) и кобальтовой смолы (E2). Показан расход (FT) из каждого столбца. Панель B: Схема фосфорилирования BAD и белковых взаимодействий во время выживания и гибели клеток (т. Е. Апоптоза). Панель C: покрытие последовательности белка BAD, показывающее идентифицированные сайты консенсусного фосфорилирования Akt (красный прямоугольник). Панель D: МС-спектры меченного стабильным изотопом BAD пептида HSSYPAGTEDDEGmGEEPSPFr.


    Белки связываются друг с другом посредством комбинации гидрофобных связей, сил Ван-дер-Ваальса и солевых мостиков в специфических доменах связывания каждого белка. Эти домены могут быть небольшими связывающими щелями или большими поверхностями и могут состоять всего из нескольких пептидов или состоять из сотен аминокислот. На силу связывания влияет размер связывающего домена. Одним из примеров общего поверхностного домена, который способствует стабильным межбелковым взаимодействиям, является лейциновая молния, которая состоит из α-спиралей на каждом белке, которые связываются друг с другом параллельным образом посредством гидрофобного связывания регулярно расположенных остатков лейцина на каждом α -спираль, которая выступает между соседними спиральными пептидными цепями.Из-за плотной молекулярной упаковки лейциновые молнии обеспечивают стабильное связывание для мультибелковых комплексов, хотя все лейциновые молнии не связываются одинаково из-за нелейциновых аминокислот в α-спирали, которые могут уменьшить молекулярную упаковку и, следовательно, прочность взаимодействие.

    Два домена гомологии Src (SH), Sh3 и Sh4, являются примерами общих временных связывающих доменов, которые связывают короткие пептидные последовательности и обычно обнаруживаются в сигнальных белках. Домен Sh3 распознает пептидные последовательности с фосфорилированными остатками тирозина, которые часто указывают на активацию белка.Домены Sh3 играют ключевую роль в передаче сигналов рецептора фактора роста, во время которой лиганд-опосредованное фосфорилирование рецептора по остаткам тирозина привлекает нижестоящие эффекторы, которые распознают эти остатки через их домены Sh3. Домен Sh4 обычно распознает богатые пролином пептидные последовательности и обычно используется киназами, фосфолипазами и GTPases для идентификации белков-мишеней. Хотя оба домена Sh3 и Sh4 обычно связываются с этими мотивами, специфичность для различных белковых взаимодействий диктуется соседними аминокислотными остатками в соответствующем мотиве.


    Биологические эффекты белок-белковых взаимодействий

    Результат двух или более белков, которые взаимодействуют с определенной функциональной целью, можно продемонстрировать несколькими различными способами.Измеримые эффекты белковых взаимодействий описаны следующим образом:

    • Изменение кинетических свойств ферментов, что может быть результатом незначительных изменений связывания субстрата или аллостерических эффектов
    • Обеспечение канализации субстрата путем перемещения субстрата между доменами или субъединицами, что в конечном итоге приводит к желаемому конечному продукту
    • Создать новый сайт связывания, обычно для малых эффекторных молекул
    • Инактивировать или разрушить белок
    • Изменение специфичности белка в отношении его субстрата посредством взаимодействия с различными партнерами по связыванию, e.g., продемонстрировать новую функцию, которую ни один белок не может проявлять по отдельности
    • Выполнять регулирующую роль как в восходящем, так и в нисходящем событии

    Общие методы анализа белок-белковых взаимодействий

    Обычно для проверки, характеристики и подтверждения белковых взаимодействий необходимо сочетание методов.Ранее неизвестные белки могут быть обнаружены по их ассоциации с одним или несколькими известными белками. Анализ взаимодействия белков может также выявить уникальные, непредвиденные функциональные роли хорошо известных белков. Обнаружение или проверка взаимодействия - это первый шаг на пути к пониманию того, где, как и при каких условиях эти белки взаимодействуют in vivo, а также функциональных последствий этих взаимодействий.

    Хотя различных методов и подходов к изучению межбелковых взаимодействий слишком много, чтобы описывать их здесь, приведенная ниже таблица и оставшаяся часть этого раздела посвящены общим методам анализа межбелковых взаимодействий и типам взаимодействий, которые могут быть изучены с использованием каждого из них. метод.Таким образом, стабильные белок-белковые взаимодействия легче всего выделить физическими методами, такими как коиммунопреципитация и анализ методом pull-down, поскольку белковый комплекс не распадается с течением времени. Слабые или временные взаимодействия можно идентифицировать с использованием этих методов, сначала ковалентно сшивая белки, чтобы заморозить взаимодействие во время co-IP или pull-down. Альтернативно, перекрестное сшивание, наряду с переносом метки и анализом дальнего вестерн-блоттинга, можно проводить независимо от других методов для идентификации межбелковых взаимодействий.

    Общие методы анализа различных типов белковых взаимодействий

    Метод Белковые взаимодействия
    Коиммунопреципитация (co-IP) Стабильный или прочный
    Нисходящий анализ Стабильный или прочный
    Анализ взаимодействия сшивающего белка Кратковременный или слабый
    Анализ взаимодействия белков переноса метки Кратковременный или слабый
    Дальневосточный блот-анализ Умеренно стабильный

    Коиммунопреципитация (ко-IP)

    Коиммунопреципитация (co-IP) - популярный метод обнаружения взаимодействия белков.Co-IP проводится по существу так же, как иммунопреципитация (IP) одного белка, за исключением того, что целевой белок, осажденный антителом, также называемый «приманкой», используется для соосаждения комплекса связывающий партнер / белок. , или «добыча», из лизата. По существу, взаимодействующий белок связывается с антигеном-мишенью, который связывается антителом, иммобилизованным на носителе. Иммунопреципитированные белки и их партнеры по связыванию обычно обнаруживаются электрофорезом в полиакриламидном геле с додецилсульфатом натрия (SDS-PAGE) и вестерн-блоттингом.Предположение, которое обычно делается при соосаждении связанных белков, состоит в том, что эти белки связаны с функцией антигена-мишени на клеточном уровне. Однако это только предположение, которое подлежит дальнейшей проверке.

    Совместная иммунопреципитация циклина B и Cdk1 . Магнитные гранулы Thermo Scientific Pierce Protein A / G связываются с антителом Cdk1 в комплексе с Cdk1. Циклин B связан с Cdk1 и захватывается вместе со своим партнером по связыванию.


    Анализ

    Pull-down схож по методологии с коиммунопреципитацией, поскольку для очистки взаимодействующих белков используется подложка из гранул. Однако разница между этими двумя подходами заключается в том, что в то время как co-IP использует антитела для захвата белковых комплексов, в методах «pull-down» используется белок «приманка» для очистки любых белков в лизате, которые связываются с приманкой.Нисходящие анализы идеально подходят для изучения сильных или стабильных взаимодействий или тех, для которых нет антител для коиммунопреципитации.

    Общая схема анализа методом «выпадающего списка». Нисходящий анализ - это мелкомасштабная методика аффинной очистки, аналогичная иммунопреципитации, за исключением того, что антитело заменяется какой-либо другой системой аффинности. В этом случае аффинная система состоит из глутатион-S-трансферазы (GST), белка или связывающего домена, меченного полигис- или стрептавидином, который захватывается глутатионом, хелатом металла (кобальт или никель) или покрытыми биотином агарозными шариками. , соответственно.Иммобилизованный белок, меченный слиянием, действует как «приманка» для захвата предполагаемого партнера по связыванию (т.е. «жертвы»). В типичном нисходящем анализе иммобилизованный белок-приманка инкубируется с клеточным лизатом, и после предписанных этапов промывки комплексы выборочно элюируются с использованием конкурирующих аналитов или буферов с низким pH или восстанавливающих буферов для анализа в геле или вестерн-блоттинга.


    Анализ взаимодействия сшивающего белка

    Большинство белок-белковых взаимодействий являются временными, лишь кратковременно происходящими как часть единственного каскада или другой метаболической функции внутри клеток.Сшивание взаимодействующих белков - это подход к стабилизации или постоянному соединению компонентов комплексов взаимодействия. Как только компоненты взаимодействия ковалентно сшиты, другие стадии (например, лизис клеток, аффинная очистка, электрофорез или масс-спектрометрия) могут быть использованы для анализа взаимодействия белок-белок при сохранении исходного взаимодействующего комплекса.

    Гомобифункциональные сшивающие агенты, реагирующие с амином, могут быть добавлены к клеткам для сшивания потенциально взаимодействующих белков вместе, которые затем могут быть проанализированы после лизиса с помощью вестерн-блоттинга.Сшивающие агенты могут быть мембранопроницаемыми, такими как DSS, для сшивания внутриклеточных белков, или они могут быть непроницаемыми для мембраны, такими как BS3, для сшивания белков клеточной поверхности. Кроме того, некоторые сшивающие агенты могут быть расщеплены восстанавливающими агентами, такими как DSP или DTSSP, для обращения сшивок.

    В качестве альтернативы, гетеробифункциональные сшивающие агенты, которые содержат фотоактивируемую группу, такие как продукт SDA или Sulfo-SDA, могут быть использованы для фиксации временных взаимодействий, которые могут происходить, например, после определенного стимула.Фотоактивация также может происходить после метаболического мечения фотоактивируемыми аминокислотами, такими как L-фото-лейцин или L-фото-метионин.

    Сайты сшивания между белками могут быть картированы с высокой точностью с помощью масс-спектрометрии, особенно если используется расщепляемый МС сшивающий агент, такой как DSSO или DSBU.


    Анализ взаимодействия белков переноса меток

    Перенос метки включает сшивание взаимодействующих молекул (т.е.е., белки наживки и жертвы) с меченым сшивающим агентом, а затем расщепляют связь между приманкой и добычей, так что метка остается прикрепленной к жертве. Этот метод особенно ценен из-за его способности идентифицировать белки, которые слабо или временно взаимодействуют с интересующим белком. Новые неизотопные реагенты и методы продолжают делать этот метод более доступным и простым в использовании для любого исследователя.

    Экспериментальная стратегия переноса биотиновой метки Sulfo-SBED и анализа методом вестерн-блоттинга.


    Дальневосточный блот-анализ

    Подобно тому, как анализы «pull-down» отличаются от ко-IP в обнаружении белок-белковых взаимодействий с использованием меченых белков вместо антител, так и анализ дальнего вестерн-блоттинга отличается от анализа вестерн-блоттингом , поскольку выявляются белок-белковые взаимодействия. путем инкубации белков, подвергнутых электрофорезу, с очищенным, меченым белком-приманкой вместо антитела, специфичного к целевому белку, соответственно.Термин «далеко» был принят, чтобы подчеркнуть это различие.

    Схема дальнего вестерн-блоттинга для анализа белок-белковых взаимодействий. В этом примере меченый белок-приманка используется для зондирования переносящей мембраны или геля на предмет белка жертвы. После связывания антитело, конъюгированное с ферментом (пероксидаза хрена; HRP), которое нацелено на бирку-приманку, используется для обозначения взаимодействия, которое затем обнаруживается ферментативной хемилюминесценцией. Этот общий подход может быть скорректирован с помощью немаркированного белка приманки, который обнаруживается антителами, биотинилированного белка приманки, обнаруживаемого конъюгированным с ферментом стрептавидина, или меченного радиоактивным изотопом белка приманки, обнаруживаемого при воздействии на пленку.


    1. Golemis E (2002) Белковые взаимодействия: Руководство по молекулярному клонированию. Колд-Спринг-Харбор (Нью-Йорк): Лаборатория Колд-Спринг-Харбор. p ix, 682.
    2. Phizicky EM, Fields S (1995) Белковые взаимодействия: методы обнаружения и анализа. Microbiol Rev 59: 94–123.

    Взаимодействие белок-белок - обзор

    6 Взаимодействие белок-белок

    ИПП являются частью так называемого интерактома, т.е.е., полный набор взаимодействий в живом организме (Garcia-Garcia et al., 2012). Регулирование ИПП - привлекательная стратегия при открытии новых лекарств. Это связано с тем, что многие клеточные функции регулируются мультибелковыми комплексами, которые контролируются PPI между белковыми субъединицами. Хорошо известно, что заболевания человека могут быть вызваны отклонениями от нормы ИЦП. Следовательно, модуляторы ИПП, либо ингибиторы, либо стабилизаторы, привлекательны для открытия новых лекарств (Zinzalla & Thurston, 2009). Например, тирофибан и маравирок являются лекарствами, нацеленными на ИПП, и одобрены для клинического применения.Тирофибан - это антиагрегантный препарат, а маравирок - антиретровирусный препарат, используемый для лечения ВИЧ-инфекции.

    Взаимодействие между белками может быть проанализировано экспериментально и вычислительно на разных уровнях детализации, от высокого структурного уровня (например, специфические молекулярные взаимодействия на границе белок-белок, конформационные изменения, которые происходят во время взаимодействия) до более низких уровней, таких как коэкспрессия и колокализация. В отличном обзоре Garcia-Garcia et al.обсудить экспериментальные и вычислительные подходы, используемые для характеристики ИЦП с разной степенью разрешения, включая цели и проблемы каждого метода (Garcia-Garcia et al., 2012).

    Интерфейсы связывания белок-белок характеризуются наличием «горячих точек», то есть остатков, которые обеспечивают большую долю свободной энергии связывания. Известно, что при использовании экспериментальных подходов, таких как сканирование аланина, в горячих точках часто встречаются остатки триптофана, аргинина и тирозина.Тирозин, фенилаланин, триптофан и лейцин считаются типичными «якорными остатками», то есть остатками с большой скрытой областью, присутствие которых должно обнаруживать лекарственные карманы (карманы связывания малых молекул) на границе раздела белок-белковый комплекс (Falchi, Caporuscio , & Реканатини, 2014).

    Общие подходы к проектированию и разработке модуляторов PPI включают биофизические методы, такие как ЯМР и рентгеновская кристаллография, подходы на основе фрагментов, высокопроизводительный скрининг и вычислительные или in silico подходы.Bienstock недавно проанализировал последние достижения в области вычислительных подходов к вычислению стыковки белок-белок, методов in silico для определения горячих точек межбелкового интерфейса, баз данных для классификации интерфейсов белок-белок по категориям и обобщения способов взаимодействия белков, а также успешных конструктивных антагонистов и небольших ингибиторы молекул ИПП (Bienstock, 2012).

    Недавний успешный пример виртуального скрининга ингибиторов PPI проиллюстрирован работой группы Meurice и его сотрудников, которая обнаружила небольшую молекулу, которая нарушает взаимодействие между TWEAK и Fn14.TWEAK - это многофункциональный цитокин, контролирующий ряд клеточных активностей и проявляющий свой эффект путем связывания с Fn14, членом суперсемейства TNFR. Нарушение регуляции передачи сигналов TWEAK – Fn14 наблюдается при раке и некоторых других болезненных состояниях. Докинг белок-белок с последующей расстановкой приоритетов на основе данных позволил предположить две многообещающие гипотезы связывания TWEAK-Fn14. Анализ мутагенеза подтвердил одну гипотезу, предоставив новую структурную основу для целевой идентификации низкомолекулярных ингибиторов взаимодействия TWEAK – FN14.Целенаправленный набор данных о соединениях был построен с использованием высокопроизводительной стыковки и виртуального скрининга на основе фармакофоров. Экспериментальный итеративный скрининг целевой библиотеки привел к идентификации молекул, производящих до 37% ингибирования связывания TWEAK-Fn14 и действующих по механизму (Dhruv et al., 2013). Несколько других успешных применений протоколов виртуального скрининга, основанных на фармакофорном моделировании, стыковке и прогнозировании горячих точек и карманов с лекарственными средствами, были подробно рассмотрены Falchi et al.(2014).

    Подобно усилиям по открытию лекарств, сфокусированным на взаимодействиях между небольшими молекулами и белками, растущая информация, связанная с идентификацией модуляторов ИПП, требует интеграции химиоинформатических инструментов с классическим молекулярным моделированием для эффективного использования ИПП для открытия лекарств.

    Используя методы химиоинформатики и машинного обучения, Neugebauer et al. построили и проверили дерево решений для дифференциации набора из 25 ингибиторов ИПП, структурно отличающихся от 1137 одобренных лекарств и малых молекул, хранящихся в базе данных ZINC (Neugebauer, Hartmann, & Klein, 2007).Дерево решений содержит по три дескриптора каждого; авторы определили, что один конституциональный дескриптор, связанный с формой и размером, имеет большое значение (Neugebauer et al., 2007).

    Совсем недавно Hamon et al. разработал инструмент машинного обучения под названием 2P2I HUNTER для фильтрации предполагаемых ортостерических модуляторов PPI. Используя 2P2I HUNTER, авторы создают библиотеку, ориентированную на PPI, содержащую 143 218 малых молекул от поставщиков химических веществ. Для разработки этой библиотеки инструмент машинного обучения был применен к 8.3 миллиона соединений из коммерческих источников (Hamon et al., 2013). Подмножество из 51 476 соединений было дополнительно определено по приоритету на основе химических каркасов, рассматриваемых как привилегированные каркасы в медицинской химии. Дальнейший отбор, основанный на структурном разнообразии и структурной сложности, приводит к созданию целевого набора из 1683 соединений в качестве потенциальных модуляторов PPI (Hamon et al., 2013).

    Cao et al. разработал платформу, названную PyDPI (взаимодействие лекарств и белков с Python). PyDPI - это набор инструментов phyton для расчета структурных и физико-химических характеристик белков и пептидов на основе аминокислотных последовательностей, молекулярных дескрипторов молекул лекарств на основе их топологии и дескрипторов PPI и PLI.Этот набор инструментов, свободно доступный по адресу https://sourceforge.net/projects/pydpicao/, является «хорошим примером интеграции хемоинформатики и биоинформатики в платформу хемогеномики для открытия лекарств». PyDPI вычисляет шесть основных типов дескрипторов для белков и пептидов, которые ранее использовались для прогнозирования проблем, связанных с белками и пептидами. Для небольших молекул пакет phyton вычисляет 12 групп молекулярных дескрипторов (Cao et al., 2013).

    Учикога и Хирокава внедрили IFP для обработки результатов стыковки белок-белок, уделяя особое внимание кластерным решениям стыковки гибких белков.IFP основаны на бинарных состояниях взаимодействующих аминокислотных остатков и использовались в качестве средства для измерения уникального сходства между сложными структурами. IFP предлагают альтернативу сравнению решений белок-белковой стыковки на основе RMSD (Uchikoga & Hirokawa, 2010). Учикога и Хирокава прокомментировали, что IFP позволяет исследовать свойства PPI, просто сравнивая стыковочные структуры с точки зрения их паттернов взаимодействия, используя метрику, обычно используемую для малых молекул, такую ​​как коэффициент Танимото.Таким образом, с помощью IFP можно было выбрать структуры, близкие к естественным, на уровне цепочки контактных остатков, а не получать точную сложную структуру на уровне декартовых координат.

    Обнаружение взаимодействия белок-белок: методы и анализ

    Взаимодействие белок-белок играет ключевую роль в прогнозировании белковой функции целевого белка и лекарственной способности молекул. Большинство генов и белков реализуют результирующие фенотипические функции как набор взаимодействий. Методы in vitro и in vivo, такие как аффинная очистка, Y2H (гибрид дрожжей 2), TAP (тандемная аффинная очистка) и т. Д., Имеют свои собственные ограничения, такие как стоимость, время и т. больше ложных срабатываний, чтобы пояснить функцию молекул лекарства.Таким образом, были разработаны методы in silico, которые включают подходы на основе последовательностей, подходы на основе структуры, близость хромосом, слияние генов, гибрид in silico 2, филогенетическое дерево, филогенетический профиль и подходы, основанные на экспрессии генов. Выяснение сетей взаимодействия белков также вносит большой вклад в анализ путей передачи сигнала. Недавние разработки также привели к созданию сетей, имеющих все взаимодействия белок-белок, с использованием вычислительных методов для сигнальных путей и идентификации белковых комплексов при определенных заболеваниях.

    1. Введение

    Белковые взаимодействия (ИПП) регулируют широкий спектр биологических процессов, включая межклеточные взаимодействия, метаболический контроль и контроль развития [1]. Белково-белковое взаимодействие становится одной из основных задач системной биологии. Нековалентные контакты между боковыми цепями остатков лежат в основе сворачивания белка, сборки белка и PPI [2]. Эти контакты вызывают различные взаимодействия и ассоциации между белками. Основываясь на контрастных структурных и функциональных характеристиках, ИПП можно классифицировать несколькими способами [3].В зависимости от поверхности взаимодействия они могут быть гомо- или гетероолигомерными; судя по их стабильности, они могут быть обязательными или необязательными; если судить по их стойкости, они могут быть временными или постоянными [4]. Данный PPI может быть комбинацией этих трех конкретных пар. Временные взаимодействия будут формировать сигнальные пути, в то время как постоянные взаимодействия будут формировать стабильный белковый комплекс.

    Обычно белки практически не действуют как изолированные виды, выполняя свои функции in vivo [5].Выявлено, что более 80% белков действуют не поодиночке, а комплексно [6]. Обширный анализ аутентифицированных белков показывает, что белки, участвующие в одних и тех же клеточных процессах, неоднократно обнаруживают, что они взаимодействуют друг с другом [7]. Изучение ИПП также важно для определения функции белка в клетке. Функциональность неидентифицированных белков можно предсказать на основании доказательства их взаимодействия с белком, функция которого уже раскрыта. Детальное изучение ИПП ускорило моделирование функциональных путей, чтобы проиллюстрировать молекулярные механизмы клеточных процессов [4].Характеристика взаимодействий белков в данном протеоме будет феноменальной для выяснения биохимии клетки [4]. Результат взаимодействия двух или более белков с определенной функциональной целью может быть установлен несколькими способами. Существенные свойства PPI были отмечены Phizicky и Fields [8].

    PPI могут (i) модифицировать кинетические свойства ферментов; (ii) действовать как общий механизм, позволяющий осуществлять субстратный канал; (iii) создавать новый сайт связывания для малых эффекторных молекул; (iv) инактивировать или подавлять белок; (v) изменять специфичность белка в отношении его субстрата посредством взаимодействия с различными партнерами по связыванию; (vi) выполнять регуляторную роль либо на верхнем, либо на нижнем уровне.

    Обнаружение информации о межбелковом взаимодействии помогает в идентификации мишеней для лекарств [9]. Исследования показали, что белки с большим числом взаимодействий (хабов) могут включать, среди прочего, семейства ферментов, факторы транскрипции и внутренне неупорядоченные белки [10, 11]. Однако ИЦП связаны с более разнородными процессами, и объем их регулирования велик. Для более точного понимания их важности в клетке необходимо идентифицировать различные взаимодействия и определять последствия этих взаимодействий [4].

    В последние годы данные PPI были улучшены с помощью гарантированно высокопроизводительных экспериментальных методов, таких как двухгибридные системы, масс-спектрометрия, фаговый дисплей и технология белковых чипов [4]. На основе этих экспериментальных ресурсов были построены комплексные сети PPI. Тем не менее, объемный характер данных PPI затрудняет лабораторную валидацию. Вычислительный анализ сетей PPI все чаще становится обязательным инструментом для понимания функций неизученных белков.В настоящее время белок-белковое взаимодействие (ИПП) является одной из ключевых тем развития и прогресса современной системной биологии.

    2. Классификация методов обнаружения ИПП

    Методы обнаружения белок-белкового взаимодействия категориально подразделяются на три типа: методы in vitro, in vivo и in silico. В методиках in vitro данная процедура выполняется в контролируемой среде вне живого организма. Методами обнаружения PPI in vitro являются тандемная аффинная очистка, аффинная хроматография, коиммунопреципитация, белковые матрицы, комплементация белковых фрагментов, фаговый дисплей, рентгеновская кристаллография и ЯМР-спектроскопия.В методах in vivo данная процедура выполняется на всем живом организме. Методами обнаружения ИПП in vivo являются двугибридные дрожжи (Y2H, Y3H) и синтетическая летальность. Методы in silico выполняются на компьютере (или) посредством компьютерного моделирования. Методы in silico в обнаружении PPI - это подходы на основе последовательностей, подходы на основе структуры, близости хромосом, слияния генов, гибрид in silico 2, зеркальное дерево, филогенетическое дерево и подходы, основанные на экспрессии генов. Схематическая классификация приведена в таблице 1.


    Подход Техника Резюме

    In vitro Тандемная аффинная масс-спектроскопия с очисткой (TAP-MS) TAP-MS основывается на двойном тегировании интересующего белка в его хромосомном локусе, за которым следуют два -стадийный процесс очистки и масс-спектроскопический анализ
    Аффинная хроматография Аффинная хроматография очень чувствительна, может даже обнаруживать самые слабые взаимодействия в белках, а также одинаково тестирует все образцы белков на взаимодействие
    Коиммунопреципитация Коиммунопреципитация подтверждает взаимодействия с использованием экстракта цельной клетки, где белки присутствуют в своей нативной форме в комплексе смесь клеточных компонентов
    Белковые микроматрицы (H) Анализ на основе микроматриц позволяет одновременно анализировать тысячи параметров в рамках одного эксперимента
    Комплементация белков-фрагментов Анализы комплементации белков-фрагментов (PCAs) могут может использоваться для обнаружения PPI между белками любой молекулярной массы и экспрессируется на их эндогенных уровнях
    Фаговый дисплей (H) Подход с фаговым дисплеем, основанный на включении белка и генетических компонентов в одну фаговую частицу
    X-ra y-кристаллография Рентгеновская кристаллография позволяет визуализировать белковые структуры на атомном уровне и улучшает понимание взаимодействия и функции белков
    ЯМР-спектроскопия ЯМР-спектроскопия может даже обнаруживать слабые белок-белковые взаимодействия

    In vivo Гибрид дрожжей 2 (Y2H) (H) Двугибридные дрожжи обычно проводят путем скрининга представляющего интерес белка по случайной библиотеке потенциальных белков-партнеров
    Синтетическая летальность Синтетическая летальность основан на функциональных взаимодействиях, а не на физическом взаимодействии

    In silico Метод последовательностей на основе ортологов Подход на основе последовательностей на основе ортологов, основанный на гомологичной природе запрашиваемого белка в аннотированных базах данных белков с использованием попарно алгоритм локальной последовательности ithm
    Подход на основе последовательностей на основе доменных пар Подход, основанный на доменных парах, предсказывает взаимодействия белков на основе взаимодействий домен-домен
    Подходы на основе структуры Подходы на основе структуры предсказывают межбелковое взаимодействие, если два белка имеют схожую структуру (первичную, вторичную или третичную)
    Окрестности гена Если соседство гена законсервировано в нескольких геномах, тогда существует потенциальная возможность функционального связывания между белками, кодируемыми родственными генами
    Слияние генов Слияние генов, которое часто называют как метод Розеттского камня, основан на концепции, что некоторые из однодоменных белков в одном организме могут сливаться с образованием многодоменного белка в других организмах
    Гибрид In silico 2 (I2H) Метод I2H основан исходя из предположения, что взаимодействующие белки должны претерпевать коэволюцию, чтобы функция белков была надежной
    Филогенетическое дерево Метод филогенетического дерева предсказывает взаимодействие белок-белок на основе истории эволюции белка
    Филогенетический профиль Филогенетический профиль предсказывает взаимодействие между двумя белками, если они имеют один и тот же филогенетический профиль
    Экспрессия гена Экспрессия гена предсказывает взаимодействие на основе идеи о том, что белки из генов, принадлежащих к общим кластерам профилирования экспрессии, с большей вероятностью будут взаимодействовать друг с другом, чем белки из генов, принадлежащих к разным кластерам

    2.1. Методы in vitro прогнозирования белок-белковых взаимодействий

    TAP-тегирование было разработано для изучения ИПП во внутренних условиях клетки [12]. Гэвин и др. впервые предпринял попытку высокопроизводительного метода TAP-tagging для анализа дрожжевого взаимодействия [13]. Этот метод основан на двойной маркировке интересующего белка на его хромосомном локусе с последующим двухэтапным процессом очистки [14]. Белки, которые остаются связанными с целевым белком, затем могут быть исследованы и идентифицированы с помощью SDS-PAGE [15] с последующим масс-спектрометрическим анализом [15], тем самым идентифицируя сотрудника PPI исходного интересующего белка.Важным преимуществом TAP-tagging является его способность идентифицировать широкий спектр белковых комплексов и тестировать активность мономерных или мультимерных белковых комплексов, существующих in vivo [14]. TAP при использовании с масс-спектроскопией (МС) будет определять взаимодействия белков и белковые комплексы.

    Преимущество аффинной хроматографии заключается в том, что она очень чувствительна, может обнаруживать даже самые слабые взаимодействия в белках, а также тестирует все образцы белков в равной степени на взаимодействие со связанным белком в колонке.Однако ложноположительные результаты также возникают в колонке из-за высокой специфичности белков, даже если они не участвуют в клеточной системе. Таким образом, исследования взаимодействия белков не могут полностью полагаться на аффинную хроматографию и, следовательно, требуют других методов для перекрестной проверки и подтверждения полученных результатов. Аффинная хроматография также может быть связана с методом SDS-PAGE и масс-спектроскопией для получения высокопроизводительных данных.

    Коиммунопреципитация подтверждает взаимодействия с использованием экстракта целых клеток, где белки присутствуют в своей нативной форме в сложной смеси клеточных компонентов, которые могут потребоваться для успешных взаимодействий.Кроме того, использование эукариотических клеток делает возможной посттрансляционную модификацию, которая может быть существенной для взаимодействия и которая не происходит в системах экспрессии прокариот.

    Белковые микрочипы быстро становятся мощным средством обнаружения белков, мониторинга уровней их экспрессии, а также определения взаимодействий и функций белков. Белковая микроматрица - это кусок стекла, на котором в разных местах упорядоченным образом закреплены различные молекулы белка [16].В настоящее время белковые микроматрицы стали свидетелями огромного прогресса и интереса и стали одной из активных областей, возникающих в биотехнологии. Целью разработки микроматрицы белков является достижение эффективного и чувствительного высокопроизводительного анализа белков с одновременным выполнением большого числа определений с помощью автоматизированного процесса.

    Анализ комплементации белков-фрагментов - еще один метод протеомики для идентификации белок-белковых взаимодействий в биологических системах.Анализы комплементации белковых фрагментов (PCA) представляют собой семейство анализов для обнаружения белок-белковых взаимодействий (PPI), которые были введены для обеспечения простых и прямых способов изучения PPI в любой живой клетке, многоклеточном организме или in vitro [17]. PCA можно использовать для обнаружения PPI между белками любой молекулярной массы и экспрессией на их эндогенных уровнях. Двумя вариантами идентификации белков с помощью масс-спектроскопии являются снятие отпечатков пептидов и протеомика дробовика [18]. Для снятия пептидных фингерпринтов элюированный комплекс отделяют с помощью SDS-PAGE.Гель окрашен либо кумасси, либо окрашен серебром, и полосы, уникальные для исследуемого образца и, возможно, содержащие единственный белок, вырезают, ферментативно расщепляют и анализируют с помощью масс-спектрометрии. Масса этих пептидов определяется и сопоставляется с базой данных пептидов для определения исходного белка. Гель также дает приблизительную оценку молекулярной массы белка. Поскольку вырезаются только уникальные полосы, фоновые полосы не идентифицируются. Обильные фоновые белки могут скрывать белки-мишени, в то время как менее обильные белки могут оказаться ниже пределов обнаружения при окрашивании.Этот метод хорошо работает с очищенными образцами, содержащими лишь небольшое количество белков. В качестве альтернативы, для протеомики дробовика, весь элюат, содержащий много белков, переваривается. В настоящее время протеомика дробовика является наиболее действенной стратегией для анализа таких сложных смесей.

    Существуют различные реализации методологии фагового дисплея, а также различные приложения [19]. Один из наиболее распространенных подходов - нитчатый фаг M13. ДНК, кодирующая интересующий белок, лигируется с геном, кодирующим один из белков оболочки вириона.Обычно за процессом следует вычислительная идентификация потенциальных взаимодействующих партнеров и этап проверки дрожжевого двугибрида, но этот метод является новым [20].

    Рентгеновская кристаллография [21], по сути, представляет собой разновидность микроскопии с очень высоким разрешением, которая позволяет визуализировать белковые структуры на атомном уровне и улучшает понимание функции белков. В частности, он показывает, как белки взаимодействуют с другими молекулами и конформационные изменения в случае ферментов.Вооружившись этой информацией, мы также можем разработать новые лекарства, нацеленные на конкретный целевой белок.

    В недавнем прошлом исследователи проявили интерес к анализу белок-белкового взаимодействия с помощью спектроскопии ядерного магнитного резонанса (ЯМР) [21]. Расположение интерфейса связывания является важным аспектом анализа взаимодействия белков. В основе спектроскопии ЯМР лежит то, что магнитно-активные ядра, ориентированные сильным магнитным полем, поглощают электромагнитное излучение с характеристическими частотами, определяемыми их химическим окружением [22, 23].

    2.2. Методы in vivo для прогнозирования белок-белковых взаимодействий

    Метод Y2H - это метод in vivo, применяемый для обнаружения ИПП [24]. Для анализа Y2H требуются два белковых домена, которые будут выполнять две специфические функции: (i) домен связывания ДНК (DBD), который помогает связываться с ДНК, и (ii) домен активации (AD), ответственный за активацию транскрипции ДНК. Оба домена необходимы для транскрипции репортерного гена [25]. Анализ Y2H позволяет напрямую распознавать PPI между парами белков.Однако этот метод может вызвать большое количество ложноположительных взаимодействий. С другой стороны, многие истинные взаимодействия нельзя отследить с помощью анализа Y2H, что приводит к ложноотрицательным результатам. В анализе Y2H взаимодействующие белки должны быть локализованы в ядре, поскольку белки, которые с меньшей вероятностью присутствуют в ядре, исключаются из-за их неспособности активировать репортерные гены. Белки, которые нуждаются в посттрансляционных модификациях для выполнения своих функций, вряд ли будут вести себя или взаимодействовать нормально в эксперименте с Y2H.Более того, если белки не находятся в их естественной физиологической среде, они не могут правильно сворачиваться для взаимодействия [26]. В течение последнего десятилетия Y2H был обогащен за счет создания новых штаммов дрожжей, содержащих множественные репортерные гены и новые векторы экспрессии, чтобы облегчить трансформацию дрожжевых клеток гибридными белками [27]. Другие широко используемые методы, такие как биолюминесцентный резонансный перенос энергии (BRET), флуоресцентный резонансный перенос энергии (FRET) и бимолекулярная флуоресцентная комплементация (BiFC), требуют обширного оборудования.FRET использует коррелированный по времени подсчет одиночных фотонов для прогнозирования взаимодействий с белками [28].

    Синтетическая летальность - важный тип генетического скрининга in vivo, который пытается понять механизмы, обеспечивающие фенотипическую стабильность, несмотря на генетические вариации, изменения окружающей среды и случайные события, такие как мутации. Эта методология производит мутации или делеции в двух или более генах, которые жизнеспособны по отдельности, но вызывают летальность при объединении вместе при определенных условиях [29–33]. По сравнению с результатами, полученными в вышеупомянутых методах, отношения, обнаруженные с помощью синтетической летальности, не требуют необходимости физического взаимодействия между белками.Поэтому мы называем этот тип отношений функциональным взаимодействием.

    2.3. Методы In Silico для прогнозирования белок-белковых взаимодействий

    Дрожжевая двугибридная (Y2H) система и другие подходы in vitro и in vivo привели к крупномасштабной разработке полезных инструментов для обнаружения белок-белковых взаимодействий (ИПП) между указанными белками, которые могут встречаться в различных комбинациях. Однако данные, полученные с помощью этих подходов, могут быть ненадежными из-за недоступности возможных PPI.Чтобы понять общий контекст потенциальных взаимодействий, лучше разработать подходы, которые предсказывают полный диапазон возможных взаимодействий между белками [4].

    Разнообразные методы in silico были разработаны для поддержки взаимодействий, которые были обнаружены экспериментальным подходом. Вычислительные методы для предсказания in silico включают подходы на основе последовательностей, подходы на основе структуры, близость хромосом, слияние генов, гибрид in silico 2, зеркальное дерево, филогенетическое дерево, онтологию генов и подходы, основанные на экспрессии генов.Список всех веб-серверов методов in silico приведен в таблице 2.

    2.3.1. Подходы к прогнозированию на основе структуры

    Идея метода на основе структуры заключается в прогнозировании взаимодействия белок-белок, если два белка имеют схожую структуру. Следовательно, если два белка A и B могут взаимодействовать друг с другом, тогда могут быть два других белка, структуры которых подобны структурам белков A и B; тогда подразумевается, что и белки также могут взаимодействовать друг с другом.Но большинство белков может не иметь известной структуры; Первый шаг для этого метода - угадать структуру белка на основе его последовательности. Сделать это можно разными способами. База данных PDB предлагает исследователям полезные инструменты и информационные ресурсы для построения структуры белка запроса [34]. Используя подход с использованием мультимерных потоков, Lu et al. [35] сделали 2865 белок-белковых взаимодействий в дрожжах, и 1138 взаимодействий были подтверждены в DIP [36].

    Недавно Hosur et al.[37] разработали новый алгоритм для вывода белок-белковых взаимодействий с использованием структурного подхода. Алгоритм Coev2Net, представляющий собой трехэтапный процесс, включает прогнозирование интерфейса привязки, оценку совместимости интерфейса с моделью, основанной на коэволюции интерфейса, и оценку степени достоверности взаимодействия [37]. Применение этого алгоритма к бинарным взаимодействиям белков повысило производительность алгоритма по сравнению с существующими методами [38]. Однако Zhang et al.[39] использовали трехмерную структурную информацию для прогнозирования PPI с точностью и охватом, которые превосходят прогнозы, основанные на неструктурных свидетельствах.

    2.3.2. Подходы к прогнозированию на основе последовательностей

    Прогнозы PPI были выполнены путем объединения свидетельств известных взаимодействий с информацией, касающейся последовательной гомологии. Этот подход основан на концепции, согласно которой взаимодействие, обнаруженное у одного вида, можно использовать для вывода о взаимодействии у других видов.Однако недавно Hosur et al. [37] разработали новый алгоритм для прогнозирования белок-белковых взаимодействий с использованием подхода, основанного на потоках, который принимает последовательности в качестве входных данных. Алгоритм iWARP (Interface Weighted RAPtor), который предсказывает, взаимодействуют ли два белка, путем комбинирования нового подхода линейного программирования для выравнивания интерфейса с повышающим классификатором [37] для предсказания взаимодействия. Гильерме Валенте и др. представил новый метод под названием Universal In Silico Predictor of Protein-Protein Interactions (UNISPPI), основанный на информации о первичной последовательности для классификации пар белков как взаимодействующих или невзаимодействующих белков [40].Ядерные методы - это гибридные методы, которые используют комбинацию свойств, таких как последовательности белков, генные онтологии и т. Д. [41]. Однако есть два разных метода в соответствии с критерием, основанным на последовательности.

    (1) Ортологический подход. Подход к предсказанию на основе последовательностей заключается в переносе аннотации из функционально определенной белковой последовательности в целевую последовательность на основе сходства. Аннотации по сходству основаны на гомологичной природе запрашиваемого белка в аннотированных базах данных белков с использованием алгоритма парных локальных последовательностей [42].Некоторые белки изучаемого организма могут иметь значительное сходство с белками, участвующими в комплексообразовании у других организмов.

    Процесс прогнозирования начинается со сравнения гена или белка зонда с аннотированными белками у других видов. Если ген или белок зонда имеет большое сходство с последовательностью гена или белка с известной функцией у другого вида, предполагается, что ген или белок зонда имеет ту же функцию или аналогичные свойства.Так аннотировано большинство субъединиц белковых комплексов. Когда функция передается от охарактеризованного белка к не охарактеризованному белку, следует применять концепции ортолога и паралога. Ортологи - это гены у разных видов, которые произошли от общего предкового гена путем видообразования. Напротив, паралоги обычно относятся к генам, связанным посредством дупликации внутри генома [43]. В широком смысле ортологи сохранят функциональность в ходе эволюции, тогда как паралоги могут приобретать новые функции.Следовательно, если два белка - A и B - взаимодействуют друг с другом, то ортологи A и B у нового вида также могут взаимодействовать друг с другом.

    (2) Подход на основе доменных пар. Домен - это отдельная, компактная и стабильная структурная единица белка, которая складывается независимо от других таких единиц. Но в большинстве случаев домены определяются как отдельные участки белковой последовательности, которые являются высококонсервативными в процессе эволюции. Как отдельные структурные и функциональные единицы, белковые домены играют важную роль в развитии прогнозирования структурных классов белков, прогнозирования субклеточного местоположения белков, прогнозирования типов мембранных белков и прогнозирования классов и подклассов ферментов.

    Обычно белковые домены используются для фундаментальных исследований, а также для создания лекарств на основе структуры. Кроме того, домены непосредственно участвуют в межмолекулярном взаимодействии и, следовательно, должны быть фундаментальными для взаимодействия белок-белок. Многочисленные исследования показали, что взаимодействия домен-домен (DDI) из разных экспериментов более согласованы, чем соответствующие им PPI [44]. Таким образом, вполне надежно использовать домены и их взаимодействия для предсказания белок-белковых взаимодействий и наоборот [45].

    2.3.3. Близость хромосом / соседство генов

    С постоянно растущим числом полностью секвенированных геномов глобальный контекст генов и белков в завершенных геномах предоставил исследователям расширенную информацию, необходимую для обнаружения взаимодействия белок-белок. Хорошо известно, что функционально родственные белки имеют тенденцию очень тесно организовываться в области генома прокариот, такие как опероны, кластеры функционально родственных генов, транскрибируемых в виде единой мРНК.Если отношение соседства сохраняется в нескольких геномах, то это будет более актуально для обозначения потенциальной возможности функциональной связи между белками, кодируемыми родственными генами. И это свидетельство было применено для изучения функциональной ассоциации соответствующих белков. Эта взаимосвязь была подтверждена экспериментальными результатами и показала, что она более независима от относительной ориентации генов. Недавно было обнаружено, что существует функциональная связь между соседними двунаправленными генами вдоль хромосомы [46].Интересно, что в большинстве случаев взаимосвязь между соседними двунаправленно транскрибируемыми генами с консервативной ориентацией генов заключается в том, что один ген кодирует транскрипционный регулятор, а другой принадлежит нерегулирующему белку [47]. Было обнаружено, что большинство регуляторов контролируют транскрипцию дайвера, аккуратно транскрибирующего целевой ген / оперон, а также автоматически регулируют свой собственный биосинтез. Эта взаимосвязь предоставляет другой способ прогнозирования процессов-мишеней и регуляторных функций для регуляторов транскрипции.Одна из ловушек этого метода заключается в том, что он непосредственно подходит для бактериального генома, поскольку соседний ген сохраняется в бактериях.

    2.3.4. Слияние генов

    Слияние генов, которое часто называют методом розеттского камня, основано на концепции, согласно которой некоторые однодоменные белки в одном организме могут сливаться с образованием многодоменного белка в других организмах [48, 49]. Этот феномен слияния доменов указывает на функциональную ассоциацию тех отдельных белков, которые, вероятно, образуют белковый комплекс.Было показано, что события слияния особенно часто встречаются у тех белков, которые участвуют в метаболическом пути [50, 51]. Этот метод можно использовать для прогнозирования межбелкового взаимодействия, используя информацию о расположении доменов в различных геномах. Однако его можно применить только к тем белкам, в которых существует структура доменов.

    2.3.5. Двухгибридный In Silico (I2h)

    Метод основан на предположении, что взаимодействующие белки должны претерпевать коэволюцию, чтобы функция белков оставалась надежной.Другими словами, если некоторые ключевые аминокислоты в одном белке изменились, соответствующие аминокислоты в другом белке, который взаимодействует с мутировавшим противоположным партнером, также должны произвести принудительные мутации. На этапе анализа общие геномы, содержащие эти два белка, будут идентифицированы посредством множественного выравнивания последовательностей, и будет рассчитан коэффициент корреляции для каждой пары остатков в одном и том же белке и между белками [52]. Соответственно, существует три различных набора для пар: два из внутрибелковых пар и один из межбелковых пар.Взаимодействие белок-белок выводится на основе разницы в распределении корреляции между взаимодействующими партнерами и отдельными белками. Поскольку анализ I2h основан на предсказании физической близости между парами остатков двух отдельных белков, результат этого метода автоматически указывает на возможное физическое взаимодействие между белками.

    2.3.6. Филогенетическое дерево

    Еще одним важным методом обнаружения взаимодействия между белками является филогенетическое дерево.Филогенетическое дерево дает историю эволюции белка. Метод зеркального дерева предсказывает белок-белковые взаимодействия, полагая, что взаимодействующие белки обнаруживают сходство в молекулярном филогенетическом дереве из-за коэволюции через взаимодействие [53]. Основополагающий принцип, лежащий в основе метода, заключается в том, что коэволюция между взаимодействующими белками может быть отражена по степени сходства матриц расстояний соответствующих филогенетических деревьев взаимодействующих белков [54].Набор организмов, общих для двух белков, выбирается из множественного выравнивания последовательностей (MSA), и результаты используются для построения соответствующей матрицы расстояний для каждого белка. Оценки BLAST также можно использовать для заполнения матриц. Затем между этими матрицами расстояний вычисляется линейная корреляция. Высокие показатели корреляции указывают на сходство между филогенетическими деревьями, и поэтому считается, что белки имеют взаимосвязь взаимодействия. Метод MirrorTree используется для обнаружения взаимосвязи коэволюции между белками, а результаты используются для вывода о возможности их физического взаимодействия.

    2.3.7. Филогенетический профиль

    Смысл этого метода заключается в том, что функционально связанные белки имеют тенденцию сосуществовать во время эволюции организма [55]. Другими словами, если два белка имеют функциональную связь в геноме, будет сильное давление на них, чтобы они унаследовались вместе в процессе эволюции [51]. Таким образом, соответствующие им ортологи в другом геноме будут сохранены или исключены. Следовательно, мы можем обнаружить присутствие или отсутствие (совпадение) белков в филогенетическом профиле.Филогенетический профиль описывает наличие определенного белка в наборе геномов: если два белка имеют один и тот же филогенетический профиль, это указывает на то, что два белка имеют функциональную связь. Чтобы построить филогенетический профиль, предварительно определенный порог значения BLASTP используется для обнаружения присутствия или отсутствия гомологических белков в целевом геноме с исходными геномами. Этот метод дает многообещающие результаты в обнаружении функциональной связи между белками и в то же время назначает функции для запроса белков.Несмотря на то, что филогенетический профиль продемонстрировал большой потенциал для построения функциональной сети сцепления на уровне полного генома, следует упомянуть следующие две ловушки: первый заключается в том, что этот метод основан на полных последовательностях генома, а другой заключается в том, что функциональная связь между белками определяется по их филогенетическому профилю, поэтому трудно использовать этот метод для тех важных белков в клетке, где нельзя обнаружить различий по филогенетическому профилю. Более того, даже несмотря на то, что увеличение числа в исходном наборе генома может улучшить точность прогноза, для этого метода может существовать верхний предел.

    Многие геномные события способствуют возникновению шума во время совместной эволюции, например, дупликация генов или возможная потеря функций генов в ходе эволюции, что может нарушить филогенетический профиль отдельных генов. Методы, основанные на филогенетическом профиле, показали удовлетворительную эффективность только на прокариотах, но не на эукариотах [56].

    2.3.8. Экспрессия гена

    Метод использует преимущество высокопроизводительного определения уровня транскрипции всего гена в организме.Экспрессия гена означает количественную оценку уровня экспрессии конкретного гена в клетке, ткани или организме в различных экспериментальных условиях и временных интервалах. Применяя алгоритмы кластеризации, различные гены экспрессии могут быть сгруппированы вместе в соответствии с их уровнями экспрессии, и результирующая экспрессия генов в различных экспериментальных условиях может помочь выявить функциональные отношения различных генов. Также было проведено множество исследований для изучения взаимосвязи между коэкспрессией генов и взаимодействием с белками [57].Основываясь на данных экспрессии дрожжей и данных протеома, белки из генов, принадлежащих к общим кластерам профилирования экспрессии, с большей вероятностью будут взаимодействовать друг с другом, чем белки из генов, принадлежащих к разным кластерам. В других исследованиях было подтверждено, что соседние гены, как правило, экспрессируются как у эукариот, так и у прокариот. Концепция коэкспрессии генов - это косвенный способ сделать вывод о взаимодействии белков, предполагая, что он может не подходить для точного обнаружения взаимодействий с белками.Однако в качестве дополнительного подхода коэкспрессия генов может использоваться для проверки взаимодействий, созданных с помощью других экспериментальных методов.

    3. Сравнение методов белок-белкового взаимодействия

    Каждый из вышеперечисленных методов применялся для обнаружения белок-белкового взаимодействия как у прокариот, так и у эукариот. Результаты показывают, что большинство из них лучше подходят для прокариот, чем для эукариот [14]. Значительное увеличение охвата этими исследованиями за последние несколько лет могло быть в основном из-за увеличения количества декодируемых геномов.Это связано с тем, что чем больше количество геномов используется в исследовании, тем выше охват, которого могут достичь методы. Ожидается, что по мере накопления полностью секвенированных геномов информационное содержание в эталонном наборе геномов будет увеличиваться. Соответственно, точность прогноза будет увеличиваться с увеличением количества геномов, включенных в исследование. Можно ожидать, что по мере того, как в будущем будет доступно все больше и больше геномов, потенциал прогнозирования будет улучшен, а соответствующие комбинированные методы получат более высокий охват и точность.Следует упомянуть, что выбор стандарта, используемого для оценки методов, имеет большое влияние на охват и точность. Помимо восстановления ключевых слов Operon и Swiss-Prot, использованных в вышеупомянутых исследованиях, KEGG использовался в качестве стандарта в базе данных Search Tool для поиска взаимодействующих генов (STRING) [58]. Можно ожидать, что охват и точность прогнозирования будут разными для каждого метода в соответствии с разными стандартами. Очевидно, что достигнутый наивысший охват для метода порядка генов, основанного на стандарте оперона, указывает на то, что метод сильно связан с опероном.

    Последние технологические достижения позволили проводить высокопроизводительные измерения белок-белковых взаимодействий в клетке, быстро создавая сети взаимодействия белков для различных видов. Однако высокопроизводительные методы, такие как двугибридный дрожжевой анализ, МС и фаговый дисплей, испытали высокий уровень шума и ложных срабатываний. Есть несколько методов проверки, чтобы узнать надежность этих высокопроизводительных взаимодействий. Это надежность профиля экспрессии (индекс EPR), метод параллельной проверки (PVM) [59] Метод локализации белка (PLM) [60] и общие меры взаимодействия IG1 [61] и IG2 [62].Метод EPR [63] сравнивает взаимодействие белков с профилями экспрессии РНК, тогда как PVM анализирует паралоги интеракторов для сравнения. Измерение IG1 основано на идее, что взаимодействующие белки, которые не имеют дальнейших взаимодействий за пределами уровня 1, скорее всего, будут ложноположительными. Мера IG2 использует топологию взаимодействий. Байесовские подходы также использовались для расчета надежности [64–66]. PLM дает истинные положительные результаты (TP) как взаимодействующие белки, которые должны быть локализованы в одном и том же клеточном компартменте или аннотированы, чтобы выполнять общую клеточную роль.Итак, чтобы противостоять этим ошибкам, было разработано множество методов, которые обеспечивают оценку достоверности каждого взаимодействия. Кроме того, методы, которые присваивают баллы отдельным взаимодействиям, обычно работают лучше, чем методы с набором взаимодействий, полученным в результате эксперимента или базы данных [67].

    4. Вычислительный анализ сетей PPI

    Сеть PPI можно описать как гетерогенную сеть белков, соединенных взаимодействиями в виде ребер. Вычислительный анализ сетей PPI начинается с иллюстрации устройства сети PPI.Простейший набросок представляет собой математический граф, состоящий из узлов и ребер [68]. Белок представлен в виде узла на таком графе, а белки, которые физически с ним взаимодействуют, представлены как смежные узлы, соединенные ребром. Исследование сети может дать самые разные результаты. Например, соседние белки на графике, вероятно, могут иметь больше одинаковых функций. Помимо функциональности, плотно связанные подграфы в сети могут образовывать белковые комплексы как единое целое в определенных биологических процессах.Таким образом, о функциональности белка можно судить по определению белков, с которыми он взаимодействует, и белковых комплексов, в которых он находится. Топологическое предсказание новых взаимодействий - это новый и полезный вариант, основанный исключительно на структурной информации, предоставляемой топологией сети PPI (PPIN) [69]. Некоторые алгоритмы, такие как алгоритм случайной компоновки, алгоритм круговой компоновки, алгоритм иерархической компоновки и т. Д., Используются для визуализации сети для дальнейшего анализа. В частности, вычислительный анализ сетей PPI является сложной задачей, с этими основными препятствиями обычно сталкиваются [4]: ​​(1) взаимодействия белков нестабильны; (2) один белок может выполнять разные роли; (3) два белка с различные функции периодически взаимодействуют друг с другом.

    5. Роль сетей PPI в протеомике

    Прогнозирование функциональности белков - одна из основных задач сети PPI. Несмотря на недавние всесторонние исследования дрожжей, в базе данных дрожжей все еще есть ряд функционально неклассифицированных белков, что отражает надвигающуюся потребность в классификации белков. Функциональная аннотация человеческих белков может обеспечить прочную основу для полного понимания клеточных механизмов, информации, которая имеет ценность для открытия и разработки лекарств [4].Повышение доступности сетей PPI привело к развитию различных вычислительных методов для прогнозирования функций белков. Доступность надежной информации о взаимодействиях белков и их присутствии в физиологических и патофизиологических процессах имеет решающее значение для разработки терапевтических средств, основанных на взаимодействии белков. Сводка всех известных белок-белковых взаимодействий (PPI) для данной клетки или организма называется интерактомом.

    Функции белков можно предсказать на основе алгоритмов модуляризации [4].Однако предсказания, полученные таким способом, могут быть неточными, поскольку точность самого процесса модуляции обычно невысока. Существуют и другие методы, которые включают подсчет соседей, хи-квадрат, марковское случайное поле, продистин и метод взвешенных взаимодействий для прогнозирования функции белка [77]. Для большей точности функции белков должны быть предсказаны непосредственно из топологии или связности сетей PPI [4]. Было предложено несколько подходов, основанных на топологии, которые предсказывают функцию белков на основе сетей PPI.На простейшем уровне «метод подсчета соседей» предсказывает функцию неизученного белка по частоте известных функций ближайших соседних белков [78]. Большинство функций ближайших соседей можно оценить статистически [79]. Недавно число общих соседей известного белка и неизвестного белка было взято за основу для вывода о функции [80]. Прогнозирование функции белков на основе взвешенного графического анализа [81] является новым подходом в этой области.

    Идентификация протеин-белкового комплекса является решающим шагом в обнаружении путей передачи сигнала. Белковые комплексы в основном состоят из комплексов антитело-антиген и протеаз-ингибитор [82]. Кристаллография - основной инструмент для определения белковых комплексов с атомным разрешением.

    Полный анализ PPI может помочь лучше понять клеточную организацию, процессы и функции. Другие приложения PPI Network включают анализ биологической незаменимости [4], оценку лекарственной способности молекулярных мишеней по топологии сети [4], оценку надежности взаимодействий [83], идентификацию доменных взаимодействий [84], прогнозирование взаимодействий белков. [85], обнаружение белков, участвующих в путях заболевания [86], определение часто встречающихся сетевых мотивов взаимодействия [87], сравнение между модельными организмами и людьми [88] и идентификация белковых комплексов [89].

    6. Базы данных по взаимодействию белков

    Огромное количество экспериментальных данных PPI, постоянно генерируемых, привело к созданию машиночитаемых биологических баз данных для организации и обработки этих данных. Например, база данных сети биомолекулярных взаимодействий (BIND) создается на основе расширяемой системы спецификаций, которая позволяет детально описать способ, которым данные PPI были получены экспериментально, часто включая прямые ссылки на заключительные доказательства из литературы [75].База данных взаимодействующих белков (DIP) - еще одна база данных экспериментально определенных бинарных взаимодействий белок-белок [36]. Биологическое общее хранилище наборов данных о взаимодействии (BioGRID) - это база данных, которая содержит информацию о белковых и генетических взаимодействиях между тринадцатью различными видами [70]. Взаимодействия регулярно добавляются путем исчерпывающего просмотра первичной литературы в базах данных. Данные о взаимодействии извлекаются из других баз данных, включая BIND и MIPS (Мюнхенский информационный центр белковых последовательностей) [90], а также непосредственно из крупномасштабных экспериментов [72].HitPredict - это ресурс белок-белковых взаимодействий с высокой степенью достоверности, на основе которого мы можем получить общее количество взаимодействий у вида для белка и просмотреть все взаимодействия с оценкой достоверности [71].

    База данных Molecular Interaction (MINT) - это еще одна база данных экспериментально полученных данных PPI, извлеченных из литературы, с добавленным элементом предоставления веса доказательств для каждого взаимодействия [72]. База данных взаимодействия белков человека (HPID) была разработана для предоставления информации о взаимодействии белков человека, предварительно вычисленной на основе существующих структурных и экспериментальных данных [91].Информацию в базе данных Hyperlinked over Proteins (iHOP) можно найти для определения ранее сообщенных взаимодействий в PubMed для интересующего белка [92]. IntAct [73] предоставляет базу данных с открытым исходным кодом и инструментарий для хранения, представления и анализа взаимодействий белков. Веб-интерфейс обеспечивает как текстовое, так и графическое представление взаимодействий белков и позволяет исследовать сети взаимодействия в контексте аннотаций GO взаимодействующих белков. Однако мы заметили, что пересечение и совпадение между этими исходными базами данных PPI относительно невелико.Недавно была осуществлена ​​интеграция, и ее можно исследовать на веб-сервере под названием APID (Agile Protein Interaction Data Analyzer), который представляет собой интерактивный веб-инструмент биоинформатики, разработанный для исследования и анализа известной в настоящее время информации о взаимодействиях белок-белок, интегрированной и унифицированной. на общей и сравнительной платформе [74]. Платформа Protein Interaction Network Analysis (PINA2.0) - это комплексный веб-ресурс, который включает в себя базу данных унифицированных данных белок-белкового взаимодействия, интегрированную из шести вручную отобранных общедоступных баз данных, и набор встроенных инструментов для построения, фильтрации и анализа сети. , и визуализация [76].Базы данных и количество взаимодействий представлены в таблице 3.

    7153 Заключение

    Хотя доступные методы не могут предсказать взаимодействия со 100% точностью, вычислительные методы уменьшат набор потенциальных взаимодействий до подмножества наиболее вероятных взаимодействий.Эти взаимодействия послужат отправной точкой для дальнейших лабораторных экспериментов. Данные об экспрессии генов и данные о взаимодействии белков повысят достоверность белок-белковых взаимодействий и соответствующую сеть PPI при совместном использовании. Недавние разработки также привели к созданию сетей, имеющих все взаимодействия белок-белок, с использованием вычислительных методов для путей передачи сигналов и идентификации белковых комплексов при определенных заболеваниях.

    Конфликт интересов

    Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов в отношении публикации данной статьи.

    Благодарность

    Авторы хотят поблагодарить Комиссию по университетским грантам (UGC) за финансовую поддержку этого исследования.

    Сети белок-белкового взаимодействия | Сетевой анализ данных взаимодействия белков

    Белковые взаимодействия (ИПП) необходимы почти для каждого процесса в клетке, поэтому понимание ИПП имеет решающее значение для понимания физиологии клетки в нормальном и болезненном состояниях. Это также важно при разработке лекарств, поскольку лекарства могут влиять на ИПП.Сети белок-белкового взаимодействия (PPIN) представляют собой математические представления физических контактов между белками в клетке. Эти контакты:

    • специфичны
    • встречаются между определенными областями связывания в белках
    • имеют особое биологическое значение (т.е. они служат определенной функции)

    Информация PPI может представлять как временные, так и стабильные взаимодействия:

    • Стабильные взаимодействия образуются в белковых комплексах (например, в белковых комплексах).грамм. рибосома, гемоглобин)
    • Временные взаимодействия - это короткие взаимодействия, которые модифицируют или переносят белок, ведущие к дальнейшим изменениям (например, протеинкиназы, импортины ядерных пор). Они составляют наиболее динамичную часть интерактома

    Знание PPI может быть использовано для:

    • назначить предполагаемые роли неохарактеризованным белкам
    • добавить подробные сведения об этапах сигнального пути
    • охарактеризовать отношения между белками, которые образуют многомолекулярные комплексы, такие как протеасома

    Интерактом

    Интерактом - это совокупность ИПП, которые происходят в клетке, организме или конкретном биологическом контексте.Разработка крупномасштабных методов скрининга PPI, особенно высокопроизводительной аффинной очистки в сочетании с масс-спектрометрией и дрожжевым двухгибридным анализом, вызвала взрывной рост количества данных PPI и создание все более сложных и полных взаимодействий ( Рисунок 16). Это экспериментальное свидетельство дополняется доступностью алгоритмов прогнозирования PPI. Большая часть этой информации доступна через базы данных молекулярных взаимодействий, такие как IntAct.

    Рис. 16. Дрожжевые (слева) и человеческие (справа) взаимодействующие клетки, полученные с использованием метода двух гибридных дрожжей.Изображения перепечатаны с разрешения Macmillan Publishers Ltd: Jeong et al. Nature 2001. 411 (3) и Rual et al. Природа 2005: 437 (4).

    Важно еще раз подчеркнуть ограниченность имеющихся данных PPI. Наши текущие знания об интерактоме неполны и зашумлены. Методы обнаружения PPI имеют ограничения относительно того, сколько действительно физиологических взаимодействий они могут обнаружить, и все они обнаруживают ложные положительные и отрицательные результаты.

    На следующих нескольких страницах мы рассмотрим некоторые свойства сетей белок-белкового взаимодействия и значение этих свойств для биологии.

    Этот сайт использует файлы cookie для повышения производительности. Если ваш браузер не принимает файлы cookie, вы не можете просматривать этот сайт.


    Настройка вашего браузера для приема файлов cookie

    Существует множество причин, по которым cookie не может быть установлен правильно. Ниже приведены наиболее частые причины:

    • В вашем браузере отключены файлы cookie. Вам необходимо сбросить настройки своего браузера, чтобы он принимал файлы cookie, или чтобы спросить вас, хотите ли вы принимать файлы cookie.
    • Ваш браузер спрашивает вас, хотите ли вы принимать файлы cookie, и вы отказались. Чтобы принять файлы cookie с этого сайта, нажмите кнопку «Назад» и примите файлы cookie.
    • Ваш браузер не поддерживает файлы cookie. Если вы подозреваете это, попробуйте другой браузер.
    • Дата на вашем компьютере в прошлом. Если часы вашего компьютера показывают дату до 1 января 1970 г., браузер автоматически забудет файл cookie. Чтобы исправить это, установите правильное время и дату на своем компьютере.
    • Вы установили приложение, которое отслеживает или блокирует установку файлов cookie. Вы должны отключить приложение при входе в систему или проконсультироваться с системным администратором.

    Почему этому сайту требуются файлы cookie?

    Этот сайт использует файлы cookie для повышения производительности, запоминая, что вы вошли в систему, когда переходите со страницы на страницу. Чтобы предоставить доступ без файлов cookie потребует, чтобы сайт создавал новый сеанс для каждой посещаемой страницы, что замедляет работу системы до неприемлемого уровня.


    Что сохраняется в файле cookie?

    Этот сайт не хранит ничего, кроме автоматически сгенерированного идентификатора сеанса в cookie; никакая другая информация не фиксируется.

    Как правило, в файлах cookie может храниться только информация, которую вы предоставляете, или выбор, который вы делаете при посещении веб-сайта. Например, сайт не может определить ваше имя электронной почты, пока вы не введете его. Разрешение веб-сайту создавать файлы cookie не дает этому или любому другому сайту доступа к остальной части вашего компьютера, и только сайт, который создал файл cookie, может его прочитать.

    Раскрытие основ специфичности межбелковых взаимодействий с помощью комбинаторно полной библиотеки

    Сводка приемки:

    Клетка - это очень плотная среда, которая склонна к беспорядочным взаимодействиям между белками. Естественный отбор, таким образом, поддерживает взаимодействия между родственными белками, а также предотвращает те, которые могут иметь пагубные последствия. Здесь Лайт и его коллеги исследуют вклад отдельных аминокислотных замен и их комбинаций в специфичность межбелкового взаимодействия с использованием системы токсин-антитоксин.Результаты обеспечивают важное понимание того, как взаимодействия белок-белок развиваются и достигают специфичности в контексте дупликации генов, когда дублированные белки изначально имеют одних и тех же партнеров по взаимодействию, но в конечном итоге развиваются, чтобы иметь своих конкретных родственных партнеров.

    Письмо-решение после экспертной оценки:

    Благодарим вас за отправку вашей статьи «Генетический ландшафт специфичности белок-белкового взаимодействия» на рассмотрение eLife. Ваша статья была рецензирована Ольгой Бодкер как старшим редактором, редактором-рецензентом и тремя рецензентами.Рецензенты предпочли остаться анонимными.

    Рецензенты обсудили рецензии друг с другом, и редактор-рецензент подготовил это решение, чтобы помочь вам подготовить исправленную заявку.

    Мы хотели бы обратить ваше внимание на изменения в нашей политике пересмотра, которые мы внесли в ответ на COVID-19 (https://elifesciences.org/articles/57162). В частности, когда редакторы решают, что представленная работа в целом принадлежит eLife, но что некоторые выводы требуют небольшого количества дополнительных новых данных, как и в случае с вашей статьей, мы просим, ​​чтобы рукопись была пересмотрена, чтобы ограничить количество утверждений теми, которые поддерживаются. имеющимися данными или прямо заявить, что соответствующие выводы требуют дополнительных подтверждающих данных.

    Мы ожидаем, что авторы в конечном итоге проведут дополнительные эксперименты и сообщат о том, как они влияют на соответствующие выводы, либо в препринте о bioRxiv или medRxiv, либо, если это уместно, в качестве исследовательского прогресса в eLife, любой из которых будет связан исходная бумага.

    Резюме:

    Lite и его коллеги изучают вклад отдельных аминокислотных замен и их комбинаций во взаимодействия белок-белок, используя систему токсин-антитоксин.Результаты дают важное представление о том, как взаимодействия белок-белок развиваются и достигают специфичности в контексте дупликации генов, когда дублированные белки изначально имеют одних и тех же партнеров по взаимодействию, но в конечном итоге развиваются, чтобы иметь своих конкретных родственных партнеров. Рецензенты оценили качество и важность работы. Они подняли несколько вопросов, которые необходимо решить.

    1) Новизна настоящего исследования по сравнению с предыдущими работами тех же и других авторов не очевидна.Контекст, в котором проводится исследование, может быть шире, чтобы лучше продемонстрировать значение работы. Некоторые предыдущие исследования, относящиеся к настоящей работе, не обсуждаются.

    2) Есть некоторые вопросы относительно способа оценки пригодности в зависимости от происхождения и анализа эпистаза.

    3) Многие анализы основаны на точных отсечениях. Было бы важно показать, что выводы устойчивы к выбору пороговых значений. Можно было бы использовать более количественную оценку результатов, чем оценку, основанную на отсечениях.

    4) Были подняты вопросы, связанные с доступностью данных.

    5) Обилие белков различных мутантов, по-видимому, не принимается во внимание, и это может быть смешивающим фактором при измерении белок-белковых взаимодействий. В идеале это должно быть решено экспериментальным путем, но это должно быть по крайней мере обсуждено, если эксперименты трудно осуществимы в текущем контексте или если такие данные еще не доступны.

    Я оставляю отдельные отчеты, приложенные ниже, потому что они в значительной степени не являются избыточными, и некоторые детали могут быть полезны для подготовки изменений.

    Рецензент № 1:

    Lite и его коллеги описывают вклад отдельных остатков в специфичность межбелкового взаимодействия в системе токсин-антитоксин parDE3. Как возникает специфичность взаимодействия в PPI, особенно после дупликации генов, является важной проблемой в эволюции. Они используют массовые конкурентные анализы в сочетании с глубоким секвенированием для количественной оценки степени, в которой мутантные антитоксины могут детоксифицировать присутствие родственного партнера по взаимодействию ParE3 и гомологичного ортогонального токсина ParE2.Новые результаты включают количественное исследование вырождения родственного интерфейса токсин-антитоксин parDE3 в сторону изменения целевых остатков, оценку относительного вклада каждого выбранного остатка в связывание и селективность антитоксина, структурную основу для различий в интерфейсе между parDE2 и parDE3 и доказательство того, что не все положительные элементы служат остатками, определяющими специфичность. Данные, представленные в этом исследовании, должны быть интересны биохимикам, эволюционным биологам и генетикам, поэтому подходят для широкой аудитории eLife.

    Lite et al., Описывают детоксикационные возможности библиотеки антитоксинов, состоящей из 8000 вариантов, в подходе, аналогичном ранее опубликованному исследованию тех же авторов (Aarke et al., 2015). Хотя новая библиотека имеет то преимущество, что она комбинаторно полная, она меньше, чем библиотека из указанного исследования, и 2/3 исследованных остатков в этой работе уже были мутированы в предыдущем исследовании (хотя и содержали только 13/10 возможных аминокислотных остатков). кислоты) Существует интересное различие между предыдущей работой, в которой использовались только естественные состояния, тогда как в этом исследовании используются все возможные мутации.Я думаю, было бы очень интересно, если бы авторы могли прокомментировать, как это может быть связано с разными результатами между исследованиями.

    В разделе «Результаты» этого исследования звучит так, как будто здесь впервые были идентифицированы остатки, переключающие специфичность. В целом, сходство с ранее опубликованными данными и экспериментальной установкой наряду с уменьшением общего размера библиотеки по сравнению с предыдущими исследованиями, в которых исследуется та же модельная система, делают новизну этой работы немного менее очевидной.Возможно, авторы могли бы еще раз концептуально (помимо насыщенности) подчеркнуть, какой новый подход добавляет это исследование, и почему он имеет решающее значение для нашего понимания специфики.

    Анализ, использованный в этой работе, не позволяет отличить хорошие антитоксины от хороших антитоксинов (как обсуждалось в подразделе «Специфичность возникает из-за различения родственных и непородных партнеров»). Чтобы решить эту проблему, авторы измеряют вклад в специфичность всех изменений отдельных аминокислот во всех возможных генетических фонах.Такой независимый от фона анализ использует полноту библиотеки (и я думаю, что впервые был использован здесь, Salinas and Ranganathan, 2018), чтобы получить средний эффект для каждой мутации, хотя я немного не уверен, что понимаю, что это уместно в этом дело. Авторы заключают, что встречающиеся в природе остатки, определяющие специфичность, являются «оптимальными в отношении стимулирования изоляции» (Введение). Мне кажется, что авторы сравнивают пригодность каждой мутации в контексте всех генетических фонов с состоянием дикого типа в контексте дикого типа, а не в контексте всех генетических фонов.Таким образом, следует ожидать, что очевидная пригодность антитоксинов, которые сохраняют родственную аминокислоту в данном положении (например, ParD3 сохраняет D в положении 1), будет <1, если они анализируются в зависимости от фона (например, DXX). Это связано с тем, что многие фоны содержат вредоносные состояния. Поэтому сравнение усредненной фоновой пригодности с приспособленностью состояния WT на одном фоне кажется мне неуместным, чтобы показать, что последовательность WT оптимальна.

    Рецензент № 2:

    В этой работе Li et al., выполнить исключительно всестороннюю оценку того, как отдельные мутации способствуют специфичности распознавания паралогичных комплексов. Авторы взяли бактериальный антитоксин ParD3 и сконструировали комбинаторную библиотеку мутагенеза с насыщением из трех положений, которые физически взаимодействуют с токсином ParE3. Затем они измеряют влияние этих мутаций на: (1) связывание родственного партнера, ParE3 и (2) связывание неродственного партнера, паралога ParE2. Авторы также сравнивают взаимодействия в этих трех положениях в кристаллических структурах комплекса ParE3 / ParD3 (опубликовано ранее) и ParE2 / ParD2 (которое они решили в этой работе).

    Центральный результат статьи состоит в том, что отдельные позиции могут действовать как положительные и отрицательные элементы для специфичности взаимодействия, и что «положительный и отрицательный вклады не являются ни взаимосвязанными по своей природе, ни взаимоисключающими». То есть, вместо использования отдельных наборов позиций для усиления родственных взаимодействий или предотвращения неконфекционного связывания, специфичность может быть (но не всегда) закодирована в перекрывающемся наборе остатков. Это имеет значение как для инженерии, так и для эволюции белковых взаимодействий.Эксперименты, как представляется, имеют высокое техническое качество, и мы ожидаем, что результаты будут интересны разнообразной научной аудитории в области биофизики, структурной биологии, белковой инженерии и молекулярной эволюции. Рекомендуем публикацию в eLife.

    Существенные изменения:

    1) На рис. 1В авторы излагают две разные модели того, как позиции на физическом интерфейсе способствуют формированию специфического белок-белкового взаимодействия. Их данные показывают, что обе модели применимы к одному белку.Похоже, что влияние статьи во многом зависит от того, насколько удивительным (или нет) это открытие, и каковы последствия этого открытия как для развивающихся, так и для инженерных комплексов. Таким образом, авторам необходимо предоставить больше контекста, который может помочь читателю четко оценить влияние этой работы. В частности, можно ли больше сказать о том, почему и когда одна модель предпочтительнее другой? Каково эволюционное значение того, что отдельные остатки в белке играют отрицательную и / или положительную роль в идентификации родственных взаимодействий? Почему удивительно, что остатки могут выполнять двойную роль в распознавании и различении у связывающего партнера?

    2) Линейная модель (рисунок 3 - дополнение к рисунку 1, рисунок 4 - дополнение к рисунку 2) показывает, что эффекты мутаций на границе раздела антитоксин / токсин можно рассматривать почти независимо.Это говорит о том, что между позициями имеется небольшой эпистаз (или связь). Однако могут ли авторы провести более тщательный анализ эпистаза второго и третьего порядка? Видят ли они, что эпистаз центрируется на нуле для среднего взаимодействия между мутациями на паре сайтов? Учитывая, что у авторов есть все данные, тщательный анализ эпистаза дополнительно подтвердит их линейную модель и покажет, что вклады каждой позиции, изученной в ParD3, независимы друг от друга.Это кажется особенно интересным, учитывая пространственную близость позиций 61 и 64.

    3) Как указывают авторы, анализы in vivo полагаются на индуцированную экспрессию токсинов и антитоксинов в гетерологичном хозяине. Они утверждают, что «относительное поведение вариантов ParD3, измеренное здесь, вероятно, применимо в любом контексте, в котором они возникают». Могут ли авторы показать, что индукционные условия не сильно влияют на их измерения? Один из способов продемонстрировать это - взять небольшую панель из ~ 10-20 мутантов ParD3, которые имеют широкий спектр эффектов на скорость роста как на фоне ParE3, так и ParE2.Затем можно измерить влияние скорости роста мутантов в этой «подбиблиотеке» при различных концентрациях IPTG (для индукции ParD3) и арабинозы (для индукции ParE2 / E3). Меняется ли ранжирование эффектов скорости роста мутантов с уровнем индукции, или результаты действительно качественно схожи?

    Рецензент № 3:

    Это интересное исследование, в котором используется комбинаторно завершенная стратегия глубокого мутагенеза для определения детерминант специфичности белок-белковых взаимодействий между бактериальными токсинами и антитоксинами с использованием паралогической пары в качестве модельной системы.Рукопись мне понравилась: она решает общий и важный вопрос с хорошим экспериментальным дизайном и с использованием элегантной системы моделей. Разъяснение отрицательного и положительного вкладов в специфичность концептуально интересно.

    Существенные изменения:

    1) Во многих анализах используется произвольное ограничение взаимодействия по сравнению с отсутствием взаимодействия (W> 0,5). Хотя это упрощает общение и анализ, важно: (1) продемонстрировать, что выводы устойчивы к выбору этого произвольного отсечения; и (2) подчеркнуть, что это снижение приспособленности является огромным и в естественных популяциях, вероятно, будут выбраны гораздо меньшие изменения приспособленности, особенно у микробов с большими эффективными размерами популяции.Как введение гораздо более высокого порога пригодности меняет выводы авторов?

    2) В целом, что касается пункта [1], я бы предпочел более количественную обработку данных. Определение белков как взаимодействующих или не взаимодействующих несколько неуклюже, учитывая, что связывание на самом деле является полностью количественным признаком, и данные здесь, по крайней мере, по замыслу, также количественные. На многие из заданных вопросов можно было бы ответить количественно, а не с помощью бинарной категоризации связывания и отсутствия связывания.

    3) А как насчет обилия белка? Авторы не оценивают количественно влияние комбинаторных мутаций на изобилие белка, поэтому некоторые неспецифические эффекты на связывание, вероятно, связаны с изменениями концентрации белка, а не сродством связывания.

    4) Связь с выводами, сделанными в предыдущих публикациях той же группы: предыдущие рукописи из той же лаборатории были сосредоточены на открытии того факта, что мутационные эффекты в интерфейсах взаимодействия белков изменяются при наличии дополнительных мутаций в том же самом белке (Podgornaia and Laub, 2015 i .е. важность парного эпистаза и эпистаза более высокого порядка). Как в количественном отношении текущий набор данных сравнивается с этим предыдущим набором данных в другой системе, а также с предыдущими наборами данных о токсин-антитоксинном мутагенезе? Являются ли мутационные эффекты менее зависимыми от фона в системе токсин-антитоксин или аналогично?

    5) «Хотя чисто аддитивная модель остаточных вкладов хорошо предсказывала приспособленность вариантов (R2 = 0,89, SD между складками + 0,003; Рисунок 3 - рисунок в приложении 1B), модель была самой слабой для наиболее подходящих вариантов, вероятно, из-за убывающая отдача от очень выгодных остатков.«Это вполне ожидаемо - мутации должны иметь аддитивные эффекты для изменений свободной энергии (связывание ddG), но не для изменений в концентрации белка из-за нелинейной зависимости между количеством белка, связанного с партнером по взаимодействию, и свободной энергией связывание (dG).

    6) Обработка данных / контроль качества. Мы попытались загрузить необработанные данные секвенирования из SRA, используя маркер рефери для выполнения некоторого базового контроля качества, но кажется возможным получить только сводные таблицы, а не фактические чтения последовательности (это может быть проблемой в целом с частными записями SRA).Можно ли получить доступ к необработанным данным, например. сделав запись полностью общедоступной до публикации для целей рецензирования?

    Мы заметили серьезные проблемы при большом количестве анализов данных глубокого мутационного сканирования, в том числе в опубликованных статьях. К ним относятся неправильная фильтрация, так что анализируемые наборы данных частично (или в некоторых случаях, в основном) состоят из ошибок секвенирования, а не из реальных вариантов, которые могут серьезно повлиять на выводы. Вторая проблема - недооценка ошибок выборки из-за чрезмерной последовательности.Для конструкции используемой здесь библиотеки и примененной фильтрации это кажется маловероятным. Но все же было бы хорошо провести некоторые базовые проверки перед публикацией.

    7) Введение / цитирование предыдущих работ. Очевидная недостающая ссылка, учитывая схожесть вопросов, стратегии, названия и журнала: Diss et al., 2018. Кроме того, в настоящее время опубликовано довольно много статей, в которых используется аналогичный комбинаторно полный дизайн глубокого мутагенеза, опубликованный на разных молекулах ( белки, РНК) и молекулярные процессы, и очень немногие из них цитируются здесь.Кроме того, утверждение во введении о том, что «в предыдущих работах не использовались комбинаторно полные библиотеки для систематического анализа остатков интерфейса», немного вводит в заблуждение, учитывая предыдущие работы лаборатории Лауба.

    8) Было бы полезно более подробно изложить в тексте (рациональный для) предыдущий дизайн библиотеки мутагенеза ParD в предыдущей публикации той же лаборатории.

    [Примечание редакции: до принятия были предложены дальнейшие изменения, как описано ниже.]

    Благодарим вас за повторное представление вашей работы под названием «Раскрытие основ специфичности белок-белкового взаимодействия с помощью комбинаторно полной библиотеки» для дальнейшего рассмотрения в eLife.Ваша исправленная статья была оценена Ольгой Боудкер (старший редактор), редактором-рецензентом и одним из первых рецензентов.

    Рукопись была улучшена, но остались некоторые незначительные проблемы, которые необходимо решить до официального принятия, как указано ниже:

    Я бы включил некоторые панели из рисунка 2 - добавление рисунка 2 к основному рисунку - по мере увеличения силы взаимодействия вырожденность интерфейса уменьшается. Думаю, это интересный момент.

    Рисунок 4C, D. Похоже, что если изменения в мутационных эффектах в зависимости от генетического фона значительны, то существует больше признаков эпистаза (переключение с полезных на пагубные мутационные эффекты) для взаимодействия с неродственным партнером. Это правда? Есть идеи, почему это может быть?

    Рисунок 3 - приложение к рисунку 1D. Существует (слабая) сигмоидальная связь между оценками пригодности, предсказанными линейной моделью, и фактическими оценками приспособленности, которая предполагает глобальный (неспецифический) эпистаз в этой системе.Это может быть потому, что существует нелинейная зависимость между изменениями свободной энергии и измеряемым фенотипом (= ~ связывание), как можно ожидать из термодинамики. И / или возможно из-за верхней или нижней границы диапазона измерения.

    https://doi.org/10.7554/eLife.60924.sa1

    Белковые взаимодействия определяют специфичность передачи сигнала

    1. Тони Поусон1 и
    2. Пирс Нэш
    1. Программа молекулярной биологии и рака, Исследовательский институт Самуэля Луненфельда, Mt.Больница Синая, Торонто, Онтарио M5G 1X5, Канада

    Практически все аспекты клеточной функции в организме многоклеточных животных, включая пролиферативный статус, метаболизм, экспрессию генов, организация цитоскелета и само выживание клетки зависит от внешних сигнальных молекул, либо в форма растворимых гормонов или белков, закрепленных на поверхности соседней клетки или внеклеточного матрикса (ЕСМ).Эти факторы оказывают свое действие либо путем связывания рецепторов, отображаемых на поверхности клетки, либо, в случае соединений такие как стероиды, проникая через плазматическую мембрану и напрямую взаимодействуя с внутриклеточными рецепторами. Кроме того, эти внешние сигналы могут быть связаны с внутренними сигналами, которые регулируют такие события, как полярность и асимметричное деление клеток, и которые контролируют молекулярный состав клетки и, следовательно, определить, преобладают ли подходящие условия для роста и деления клеток.

    За последние два десятилетия мы достигли значительного понимания механизмов, с помощью которых сигналы передаются от рецепторы на плазматической мембране к своим мишеням в цитоплазме и ядре. По сути, это проблема молекулярного распознавания. Гормоны должны избирательно связываться со своими рецепторами, а они, в свою очередь, должны взаимодействовать со специфическими цитоплазматическими мишенями. Понимать передачи сигнала в общем смысле, важно знать, используют ли различные биохимические пути связанные молекулярные устройства для управления поведением сотовой связи.Чтобы понять специфичность передачи сигналов, нам нужно знать, как рецепторы взаимодействуют с конкретных мишеней и как белки одного пути могут быть изолированы от связанных сигнальных компонентов. В то же время, важно узнать, как различные сигнальные пути взаимодействуют друг с другом, поскольку вся клетка в конечном итоге должна функционируют как единое целое, различные элементы которого организованно реагируют на внешние сигналы. Клетка в теле будет подвергаться воздействию множества различных стимулов, которые он должен объединить в согласованный ответ.

    Кроме того, хотя довольно большая часть генов в ядросодержащих клетках, по-видимому, функционирует в процессах передачи сигналов, трансдукции и клеточной организации (Plowman et al. 1999), все еще примечательно, что только несколько тысяч генных продуктов могут контролировать сложное поведение многих различных типы клеток. Это сразу предполагает, что сигнальные белки должны действовать комбинаторным образом, поскольку их недостаточно. белки для каждого, чтобы иметь единственную биологическую роль.Например, в человеческом мозгу миллиарды нейронов, каждый из которых который должен проецировать свой аксон на соответствующую мишень, не говоря уже о сложных биохимических событиях, связанных с нейротрансмиссия и синаптическая пластичность. Очевидно, что сигнальные молекулы, которые функционируют в процессе управления аксоном должен действовать комбинаторным образом, чтобы вызвать чрезвычайную сложность нервной системы человека.

    Здесь мы рассмотрим некоторые из основных биохимических механизмов, посредством которых специфичность генерируется во время передачи сигнала, и изыскать средства, с помощью которых сигнальные молекулы могут действовать в комбинации для генерации сложных биологических ответов.

    Специфичность и сложность на уровне рецепторов

    Механизмы активации рецепторов интенсивно изучались посредством анализа рецепторных тирозинкиназ (RTK), которые обладают одной трансмембранной областью и родственными мультисубъединичными рецепторами, такими как рецепторы цитокинов и антигенов которые передают сигнал через ассоциированные цитоплазматические тирозинкиназы (Hunter 2000).Связывание гормона с такими рецепторами вызывает либо олигомеризацию рецептора (Heldin et al. 1995; Plotnikov et al. 1999) или пространственную переориентацию прекластерных цепей, как показано для рецептора эритропоэтина (Remy et al. 1999). Как следствие, связывание лиганда с RTK способствует межмолекулярному аутофосфорилированию одной рецепторной цепи за счет ее сосед, обычно внутри активационного сегмента киназного домена (Hubbard 1997). Это приводит к смещению активационного сегмента с активного сайта.Затем стимулированный киназный домен фосфорилирует дополнительные остатки тирозина, обычно в некаталитических областях рецептора, которые обеспечивают сайты стыковки для нижестоящих цели.

    Исключительное связывание одного фактора роста с индивидуальным рецептором является скорее исключением, чем правилом. В самом деле, олигомерная природа активированных рецепторов позволяет формировать рецепторные комплексы, состоящие из отдельных, хотя и близко расположенных родственные субъединицы, которые могут иметь разные сигнальные потенциалы (Pinkas-Kramarski et al.1998). В качестве простого примера, фактор роста тромбоцитов (PDGF) представляет собой ковалентно связанный димер, состоящий из цепей A или B в различных комбинации, которые индуцируют образование димера рецептора, аналогичного составу α- или β-цепей (Heldin et al. 1998). Поскольку B-цепь PDGF связывается только с β-рецептором, в то время как PDGF A и B связывается с α-рецептором, разные димерные формы PDGF индуцируют различные комбинации рецепторных цепей. Интересно, что сигнальные свойства рецепторов α и β цепи отличаются друг от друга, поскольку гетеродимер рецептора α / β PDGF более эффективен в стимуляции митогенеза, чем гомомерных рецепторов.Это коррелирует с неспособностью α / β рецептора связывать белок, активирующий Ras GTPase, отрицательный результат. регулятор Ras GTPase, что приводит к усиленной активации пути Ras-MAP kinase (MAPK) (Ekman et al. 1999).

    Еще большее разнообразие можно увидеть в четырех членах семейства ErbB RTK, которые связывают несколько лигандов, включая эпидермальный фактор роста (EGF) и нейрегулины (NRG).Хотя все возможные димерные комбинации рецепторов могут образовывать ErbB2, который сам по себе не связывает лиганды с высоким сродством, является предпочтительным гетеродимерным партнером (Pinkas-Kramarski et al. 1998). Биологическая потребность в образовании гетеродимера выявляется наблюдением, что мутации в ErbB2 и ErbB4 рецепторы и лиганд NRG-1 дают по существу идентичные фенотипы у эмбрионов мыши (Gassmann et al. 1995; Lee et al. 1995; Meyer and Birchmeier 1995).Различные рецепторные цепи имеют разные цитоплазматические сайты связывания для внутриклеточных сигнальных белков и, как следствие, дают отчетливые выходные сигналы, измеряемые силой активации MAPK. Интересно, что у ErbB3 отсутствует собственная каталитическая активность, но трансфосфорилируется активным киназой партнером, таким как ErbB2, и, таким образом, выполняет функцию каркаса благодаря своей способности связывать циотплазматические мишени. Действительно, гетеродимер ErbB2 / ErbB3 является сильно митогенным (Waterman et al.1999).

    Один рецептор обычно связывается и активируется более чем одним внеклеточным лигандом. Например, пролактин рецептор цитокина может взаимодействовать как с гормоном роста, так и с пролактином. Структурный анализ и анализ мутагенеза показали, что лиганд-связывающие сайты рецепторов клеточной поверхности могут быть довольно адаптируемыми, состоящими из относительно гидрофобных, но доступных для растворителей поверхностей (Каннингем и Уэллс, 1991; Лоуман и др.1991). Хотя поверхности связывания лиганда довольно велики, только несколько остатков имеют решающее значение для распознавания лиганда. В примере цитировалось выше, два гормона распознают перекрывающиеся сайты на одном и том же рецепторе, но зависят от различных остатков для связывание с высокой аффинностью. Такие данные предполагают, что рецепторы сочетают селективность в отношении определенных лигандов с потенциалом гибкости. и возможность быстрой эволюции распознавания гормонов.Как обсуждается ниже, белок-белковые взаимодействия внутри клетки которые контролируют цитоплазматические сигнальные пути, обладают многими из тех же характеристик.

    В дополнение к образованию мультицепочечных рецепторов посредством взаимодействий отдельных субъединиц, недавние данные предполагают, что совершенно разные рецепторы могут напрямую взаимодействовать друг с другом на поверхности одной и той же клетки. Это приводит к возможности перекрестных помех между отдельными рецепторами и путями на самых ранних этапах передачи сигналов.В нервной системе γ-цепь гетеропентамерного рецептора GABA A , который является лиганд-управляемым ионным каналом, физически взаимодействует через цитоплазматическую петлю с карбокси-концом область дофаминового рецептора D5, семи трансмембранных рецепторов, связанных с G-белками (GPCR), которые связываются с Gs и производство цАМФ (Liu et al. 2000). Эта ассоциация приводит к взаимному ингибированию двух рецепторов и обеспечивает механизм, посредством которого GPCR может влиять на синаптическая сила независимо от передачи сигналов G-белка.Точно так же нейротрофины, действующие через RTK семейства Trk, могут быстро индуцируют потенциалы действия в нейронах ЦНС, предполагая, что рецепторы Trk могут взаимодействовать с каналом Na + (Kaffitz et al. 1999). Эти типы взаимодействия не ограничиваются нервной системой. Например, Kit RTK, который активируется фактор гемопоэтических стволовых клеток, может связывать и фосфорилировать цитоплазматическую область цитокинового рецептора эритропоэтина (Ву и др.1995).

    Специфическая активация сигнальных путей - белковые домены и распознавание мотивов

    Первоначально было признано участие модульных белок-белковых взаимодействий в передаче сигналов от рецепторов клеточной поверхности. в контексте РТК. Как отмечалось выше, активация рецептора приводит к межмолекулярному фосфорилированию рецепторных цепей. в сайтах, которые, следовательно, связывают белки с доменами Sh3 (Pawson 1995; Kuriyan and Cowburn 1997).Домены Sh3 представляют собой белковые модули из ~ 100 аминокислот, которые распознают пептиды, содержащие остатки фосфотирозина, в контексте 3–6 карбоксиконцевых аминокислот (Eck et al. 1993; Waksman et al. 1993; Pascal et al. 1994). Как и во многих модулях взаимодействия, амино- и карбоксильные концы доменов Sh3 расположены близко друг к другу в пространстве, а на сторона, противоположная лиганд-связывающей поверхности. Это потенциально позволяет вставить домен Sh3 в белок-хозяин на внутреннее расположение, оставляя фосфопептид-связывающую поверхность свободной для взаимодействия с лигандами.Большинство доменов Sh3 требует фосфорилирования пептидного лиганда для связывания с высоким сродством, но различаются по своей способности распознавать карбокси-концевые остатки по отношению к pTyr, тем самым наделяя каждый домен Sh3 способностью связываться преимущественно со специфическим фосфорилированным мотивом (Songyang et al. 1993). Таким образом, в случае активированных RTK их способность стимулировать цитоплазматические сигнальные пути в некоторой степени определяется. контекстами последовательностей их сайтов аутофосфорилирования, что, в свою очередь, определяет, какие Sh3-содержащие белки будут задействованы аутофосфорилированный рецептор.

    Таким образом, домены

    Sh3 должны обеспечивать балансировку. Их сродство к нефосфорилированному сайту не должно быть слишком большим. высокий, или связывание не может регулироваться фосфорилированием, но они должны получать достаточную энергию связывания от распознавания большего количества карбоксиконцевых остатков, чтобы позволить различать разные сайты. Кроме того, их скидки должны быть достаточно высокий, чтобы обеспечить быструю передачу сигнала.Возможно, по этой причине взаимодействия доменов Sh3 с фосфопептидными мотивами может быть очень динамичным (Kay et al. 1998). Например, хотя домены Sh3 фосфолипазы C (PLC) -γ1 и тирозинфосфатазы Shp2 оба связывают pTyr, пятью гидрофобными остатками домен Sh3-C PLC-γ1 получает больше энергии связи за счет электростатических взаимодействий, включающих pTyr, тогда как домен Shp2 Sh3-N имеет больший вклад от гидрофобного интерфейса.Поразительно, хотя Домены PLC-γ1 Sh3 демонстрируют высокую селективность в положениях от +1 до +5, остатки домена Sh3 выстилают гидрофобную бороздку. который вмещает эти аминокислоты, демонстрирует значительное двигательное расстройство даже после связывания лиганда. Это приводит к возможности что специфичность связывания домена Sh3 является результатом комбинации разрешающих и ингибирующих сил. Таким образом совместимые остатки в домене Sh3 и лиганде будут способствовать связыванию, тогда как остатки, которые стерически мешают распознаванию фосфопептида будет препятствовать узнаванию.В соответствии с этой точкой зрения, домены Sh3 PLC-γ1 потенциально могут связывать сайт с мотивом pYXXM, которые обычно содержат фосфатидилинозитол-3'-киназу (PI3K), но исключены из такого сайта с помощью Ser в положении +4, как обнаружено в физиологических сайтах связывания PI3K на рецепторе βPDGF (Larose et al. 1995).

    Потенциальная гибкость доменов Sh3 подчеркивается способностью одиночных аминокислотных замен изменять связывание специфичность (рис.1). Домены Sh3 обычно делятся на три класса: PLC-γ-подобные домены Sh3 связывают фосфопептиды в виде протяженной цепи с карбоксиконцевые остатки, входящие в гидрофобную щель. Src-подобные домены Sh3 похожи, но имеют плоскую поверхность связывания. который выбирает заряженные остатки в положениях +1 и +2, в то время как боковая цепь остатка +3 вписывается в гидрофобную карман. Напротив, домен Grb2 Sh3 имеет объемную боковую цепь Trp, которая блокирует продвижение фосфопептидного лиганда, который принудительно превращается в β-поворот, лучше всего приспособленный +2 Asn.Удивительно, но возможно преобразовать домен PLC-γ Sh3 в Src-подобная специфичность за счет замены одного остатка Cys (в положении βD5) на Tyr (Songyang et al. 1995). Точно так же домен Src Sh3 может быть преобразован в Grb2-подобную специфичность путем изменения Thr (в сайте EF1) на Trp. Этот мутантный домен Src Sh3 имитирует Grb2 на структурном уровне и функционирует в развитии Caenorhabditis elegans как если бы он был доменом Grb2 Sh3 (Marengere et al. 1994).Эта очевидная гибкость может иметь эволюционное преимущество в том смысле, что специфичность связывания домена Sh3 может измениться. довольно быстро, позволяя формировать новые сигнальные связи по мере того, как многоклеточные организмы становятся более сложными.

    Рисунок 1.

    Эволюция специфичности связывания домена Sh3. Поверхности доменов PLC-γ1, Src и Grb2 Sh3 показаны синим цветом с соответствующие им пептидные лиганды (pYIIPLPD, pYEEI, pYVNV, соответственно) показаны желтым цветом.В каждом случае pTyr соответствует верно. Для PLC-γ1 +1 Ile лиганда входит в начало гидрофобной бороздки, обрамленной Cys (βD5), показанной зеленым. В домене Src Sh3 этот Cys заменен на Tyr (зеленый), что создает плоскую поверхность, которая выбирает заряженные остатки. в позициях +1 и +2. Src имеет карман, который вмещает гидрофобную боковую цепь +3 Ile, которая образуется в часть с помощью Thr (EF1), показанного красным.В домене Grb2 Sh3 этот Thr заменяется на Trp (красный), который заполняет карман. и заставляет фосфпептид совершать β-поворот. Изменение Cys в PLC-γ1 на Tyr преобразует домен PLC-γ1 Sh3 в Src-подобный специфичность, и наоборот, изменение Thr в Src на Trp приводит к специфичности, подобной Grb2.

    Релевантность специфических взаимодействий, опосредованных доменом Sh3, для биологических сигнальных путей также была протестирована путем введения мутации в сайтах стыковки Sh3 на рецепторах.Хороший пример представлен гомологом рецептора EGF у C. elegans, LET-23, который необходим для дифференцировки, жизнеспособности и овуляции вюваля (Lesa and Sternberg 1997). LET-23 имеет восемь потенциальных сайтов аутофосфорилирования в пределах своего карбоксиконцевого хвоста со связывающими мотивами для белков Sh3. такие как Grb2, PLC-γ и SLI-1 (червь-гомолог c-Cbl млекопитающих). Три карбоксиконцевых сайта аутофосфорилирования (Y6-8) лежат в мотивах YXN, которые могут связывать адаптер Grb2 червя и тем самым активировать путь Ras.На этих сайтах есть дублирующие играет роль в формировании и жизнеспособности вульвы, но не требуется для овуляции. Напротив, сайт Y5, который, вероятно, сигнализирует через PLC-γ для активации рецептора инозитолтрифосфата (IP 3 ) и повышения уровня внутриклеточного кальция, играет уникальную роль в овуляции. Кроме того, сайт Y2 ингибирует передачу сигналов LET-23, потенциально через белок SLI-1 / c-Cbl Sh3, который, вероятно, действует как белок-убиквитинлигаза E3 (Joazerio et al.1999).

    В системе млекопитающих тирозинкиназа рецептора Met имеет два близко расположенных сайта фосфорилирования Tyr в пределах своего карбоксиконца. tail, которые связывают ряд Sh3-содержащих белков. Замена обоих остатков Tyr на Phe у мышей вызывает эмбриональную летальность аналогична той, которая наблюдается с нулевым аллелем, что позволяет предположить, что, хотя рецептор сохраняет киназную активность, он функционально импотент, когда лишен его Sh3-стыковочных сайтов (Maina et al.1996). Напротив, рецептор Met с более тонкой заменой, которая изменяет +2 Asn, важный для связывания Grb2, имеет более мягкую фенотип, связанный с дефектами мышечного развития. Аналогичным образом, замена Tyr 719 в RTK-наборе мыши, который обычно задействует PI3K, нарушает определенные аспекты функции Kit, необходимой для выживания мужских половых клеток (Blume-Jensen et al. 2000) и развития фолликулов яичников (Kissel et al. 2000). Однако связывание PI3K существенно не требуется для роли Kit в меланогенезе и гематопоэзе.В том же духе, Замены сайтов связывания PI3K (Tyr 739/750) в рецепторе βPDGF мыши вызывают очень тонкий фенотип, в результате при снижении хемотаксиса и способности сокращать гель коллагена в культуре, а также неспособности нормализовать давление межклеточной жидкости in vivo (Heuchel et al. 1999). Эти данные согласуются с точкой зрения, что отдельные сайты фосфорилирования рецепторов связывают сигнальные белки Sh3 в последовательность-зависимый способ, приводящий к активации определенных биохимических путей и определенных биологических ответов.

    У этого простого представления есть ряд сложностей. Во-первых, разные сигнальные пути могут в конечном итоге сходиться на перекрытии. мишени и, таким образом, имеют частично повторяющиеся функции (Fambrough et al. 1999). Во-вторых, некоторые сигнальные пути могут обладать тонкой биологической активностью. Кроме того, некоторые RTK могут фосфорилировать специфические стыковка белков по остаткам, которые впоследствии связывают белки Sh3, и обеспечивают сигнальную активность даже в отсутствие Sh3-связывания сайтов на самом рецепторе.Примеры включают белки Shc, IRS-1 и FRS2. Для них характерно наличие средств прикрепления к мембране, рецептор-связывающего домена PTB и множественных сайтов для фосфорилирования тирозина и связывания Sh3 (Sun et al. 1993; van der Geer et al. 1996; Kouhara et al. 1997).

    Поучительно рассмотреть, как эти стыковочные белки рекрутируются на активированные рецепторы. В частности, их домены PTB распознают мотивы, содержащие pTyr, хотя и совершенно иначе, чем домены Sh3 (Zhou et al.1995), и предпочтительно связывают фосфорилированные элементы NPXY в прилегающей к мембране области рецептора (Trub et al. 1995; van der Geer et al. 1995). Интересно, что все большее число белков, как было обнаружено, обладают доменами PTB, которые связывают NPXY или родственные мотивы, но не требуют фосфорилирования для связывания с высоким сродством (Borg et al. 1998). Это привело к мысли, что домены PTB изначально эволюционировали для распознавания нефосфорилированных пептидных мотивов, а впоследствии в конкретных случаях развивали способность к связыванию pTyr.Действительно, домен PTB FRS2 связывается как с фосфорилированным NPXY. сайт активированного рецептора нейротрофина TrkA и совершенно другой нефосфорилированный сайт рецептора FGF (Онг и др., 2000) (рис. 2). Довольно удивительно, что домены PTB имеют структурную складку, аналогичную доменам PH (которые связывают фосфолипиды) и доменам EVh2. (которые связывают богатые пролином мотивы), а также с белком, который связывает Ran GTPase, что позволяет предположить, что это довольно универсальный каркас, который использовался для нескольких различных событий узнавания белков и фосфолипидов (Yoon et al.1994; Prehoda et al. 1999; Веттер и др. 1999).

    Фигура 2.

    Модульные домены межбелкового взаимодействия передают сигналы от активированных рецепторов, используя множество мотивов узнавания. Оба рецептора TNF и FGF используют модульные домены межбелкового взаимодействия для передачи сигналов. Активированный TNF-R1 тример связывает стыковочный белок, TRADD, посредством взаимодействий домена смерти (DD) -DD.TRAD, в свою очередь, подключается к множеству адаптеров, включая FADD, TRAF и RIP. FADD задействует прокаспазу 8, которая инициирует протеолитический каскад, приводящий к апоптозу. Рекрутирование TRAF-2 через домен TRAF-C инициирует путь Jnk, тогда как рекрутирование RIP активирует передачу сигналов NFκB. Аналогичным образом FGF-R группируется с помощью FGF и протеогликана. Миристоилированный каркасный белок FRS2 связывается с FGF-R через свой домен PTB фосфорилируется по нескольким тирозинам и, следовательно, связывает белки Sh3 Grb2 и Шп2.Адаптер Grb2 рекрутирует Sos1 через свой домен Sh4, а Sos1 действует как GEF для Ras GTPase. Активированный Рас может потенциально стимулируют множественные пути, способствующие выживанию клеток, активируя транскрипцию или вызывая перестройку цитоскелета.

    Какой цели служат стыковочные белки, которые связываются с RTK? Одна из возможностей состоит в том, что они усиливают передачу сигналов от данный рецептор к определенному биохимическому пути.Фосфорилирование IRS-1 рецептором инсулина создает множественное связывание сайты для PI3K, тогда как Shc и FRS2 в первую очередь задействуют Grb2 и, таким образом, принципиально участвуют в активации пути MAPK. Другая роль стыковочного белка может заключаться в сопоставлении цитоплазматических белков, которые действуют на последовательных стадиях пути. An Примером может служить белок SLP-76, который функционирует ниже рецептора Т-клеточного антигена. SLP-76 - это белок Sh3. который рекрутируется на LAT-мишень Т-клеточного рецептора через адаптерный белок Sh3 / Sh4, GADS.SLP-76 затем фосфорилируется во многих сайтах с помощью ассоциированной с рецептором киназы ZAP-70 и, следовательно, связывает белки Sh3 (Liu et al. 1999). Одним из таких связывающих белков является Vav, который действует как фактор обмена гуаниновых нуклеотидов (GEF) для активации Rac GTPase. SLP-76 также связывает адаптер Sh3 / Sh4 Nck, который через свои домены Sh4 соединяется с серин / треонинкиназой Pak. Пак активирован посредством GTP-связанного Rac (продуцируемого Vav) и индуцирует реорганизацию цитоскелета.SLP-76, таким образом, функционирует как каркас, который сопоставляет члены пути, нацеленного на цитоскелет (Bubeck Wardenburg et al. 1998).

    Несколько модулей в преобразовании сигналов

    доменов Sh3 служат прототипом большого и растущего семейства модульных белковых доменов, обнаруженных во внутриклеточной передаче сигналов. белки (см. http: // smart.embl-heidelberg.de/) (Шульц и др., 2000). Помимо доменов, участвующих в распознавании pTyr- и pSer / Thr-содержащих пептидов, существует ряд модулей. которые распознают специфические богатые пролином пептидные мотивы, включая домены Sh4, WW и EVh2 (Niebuhr et al. 1997; Nguyen et al. 1998; Aghazadeh and Rosen 1999). Домены EH распознают последовательности Asn-Pro-Phe, обычно обнаруживаемые в полипептидах, участвующих в переносе белков (Salcini et al. 1997; Mayer 1999), тогда как домены PDZ связывают короткие пептидные мотивы на крайних карбоксильных концах белков, обычно трансмембранные рецепторы. (Songyang et al.1997). Два свернутых домена PDZ также могут напрямую связываться друг с другом (Hillier et al. 1999), и SAM домены, по-видимому, также обладают внутренней способностью подвергаться самоолигомеризации (Stapleton et al. 1999; Thanos et al. 1999). Помимо модулей, участвующих во взаимодействиях домен-пептид или домен-домен, есть несколько примеров доменов, которые селективно связываются с фосфолипидами и, таким образом, направляют белки на определенные участки мембраны, чтобы напрямую регулировать их активность или доступ к субстратам.В частности, домены FYVE часто связывают специфические фосфоинозитиды и, следовательно, тем самым опосредуют эффекты PI-киназ на клеточное поведение (Fruman et al. 1999; Rameh and Cantley 1999). Недавние данные свидетельствуют о том, что гомодимеризация доменов PH и FYVE может увеличивать авидность, с которой они связываются мембранные сайты (Mao et al. 2000).

    Во многих случаях цитоплазматические сигнальные белки обладают множественными доменами взаимодействия белок-белок и белок-фосфолипид, ковалентно связаны в различных комбинациях.Объединение разных доменов может выполнять множество функций. Два домена может взаимодействовать с разными сайтами на одной и той же мишени, как это обычно происходит с полипептидами, имеющими тандемные домены Sh3, тем самым повышая аффинность и специфичность взаимодействия (Ottinger et al. 1998). И наоборот, отдельные домены могут взаимодействовать с разными партнерами, как это наблюдается для адаптеров с доменами Sh3 и Sh4, такими как как Grb2, который связывает активированные рецепторы с нижестоящими мишенями с богатыми пролином мотивами, особенно с Ras GEF Sos1 (Li et al.1993; Розакис-Адкок и др. 1993) (рис.2). Кроме того, модульные домены могут участвовать в сложных внутримолекулярных взаимодействиях, которые регулируют ферментативную активность их хозяйский белок, как это происходит в киназах семейства Src или тирозинфосфатазе Shp2 (Sicheri et al. 1997; Xu et al. 1997; Hof et al. 1998). Эти роли не обязательно исключают друг друга. В тирозинкиназе Src фосфорилирование карбоксиконцевого тирозина приводит к внутримолекулярным взаимодействиям, в которых домены Sh3 и Sh4 взаимодействуют с внутренними лигандами и блокируют киназную активность.Тем не мение, как только эти внутримолекулярные взаимодействия нарушаются, домены Sh4 и Sh3 играют важную роль в связывании Src с его субстратов и в стимулировании процессивного фосфорилирования (Sakai et al. 1994; Pellicena et al. 1998).

    Общность белок-белковых взаимодействий в передаче сигналов

    Рецепторы TGFβ

    Процесс, посредством которого белок-белковые взаимодействия опосредуют передачу сигналов фосфотирозина, представляет собой особый аспект более общий процесс передачи сигналов.Члены семейства рецепторов TGFβ проявляют свои эффекты через тип 1 и тип II рецепторы с протеин-серин / треонинкиназной активностью (Massague 1998). Связывание TGFβ заставляет рецептор типа II фосфорилировать рецептор типа I, что, таким образом, индуцирует фосфорилирование нижестоящие мишени, регулируемые (R-) Smads, на трех карбоксиконцевых сайтах в мотиве SSXS. Белки Smad имеют аминоконцевой домен Mh2, центральный линкер и карбоксиконцевой домен Mh3, который распознает рецептор типа I.Р-Смад фосфорилирование, по-видимому, блокирует внутреннее взаимодействие между доменами Mh2 и Mh3 и освобождает домен Mh3 для связывания с так называемым обычным Smad (Smad4), который сам не фосфорилируется. На Smad4 был идентифицирован сайт связывания, который может служить рецептором для фосфорилированных остатков R-Smads (Qin et al. 1999). Образующийся гетероолигомерный комплекс R-Smad / Smad4 сохраняется в ядре, где он связывается со специфическими промоторами через домен Mh2 и дополнительные факторы транскрипции, такие как FAST (Wrana 2000) (рис.3).

    Рисунок 3.

    Статистика и Smads: Связывание рецепторов с транскрипцией. Активация рецептора IFNγ индуцирует протеин-тирозинкиназы Jak семья. Они действуют на цитоплазматический хвост рецептора, создавая сайты стыковки Sh3. Белки STAT привлекаются к мембраны через их домен Sh3 и сами фосфорилируются киназами Jak.Фосфорилированные СТАТ димеризуются и перемещаются в ядро, где они активируют транскрипцию, связываясь непосредственно с конкретными последовательностями ДНК. В несколько анлогичной манере R-SMAD привлекаются к активированным рецепторам TGFβ из их мембранного якорного белка SARA. После фосфоилирования R-SMAD белок образует гетеродимеры с SMAD4 и перемещается в ядро.

    Существует ряд дополнительных регуляторных шагов, которые, вероятно, способствуют биохимической и биологической специфичности TGFβ. сигнализация.Во-первых, стыковочный белок, называемый SARA, связывает домен Mh3 нефосфорилированных Smad2 и Smad3 и, по-видимому, колокализирует с рецептором TGFβ (Tsukazaki et al. 1998; Wu et al. 2000). Таким образом, SARA усиливает передачу сигналов TGFβ за счет повышения специфичности и эффективности фосфорилирования рецептора. его цели. Фосфорилированные Smads высвобождаются из своего якоря SARA. Интересно, что помимо области связывания Smad, SARA имеет домен FYVE, который распознает PI-3-P, и поэтому может направлять Smad на конкретный сайт мембраны, где он встречается рецептор.

    Хотя есть много различий в деталях между передачей сигналов рецепторов RTK и TGFβ, существует также ряд параллелей. Рецепторы-мишени имеют модульную структуру и образуют комплексы со своими рецепторами. В обоих случаях фосфорилирование регулирует белок-белок. взаимодействия, хотя и по-разному. Кроме того, как RTK, так и TGFβ-рецепторы могут использовать стыковочные белки с фосфолипид-рецепторами. и домены взаимодействия с белками, которые способствуют привлечению мишеней к рецептору.В самом деле, регуляция передачи сигналов Smad чем-то напоминает Stats, Sh3-содержащие белки, которые действуют ниже цитокиновых рецепторов и контролируют экспрессию генов. (Дарнелл 1997) (Рис.3). Статистические данные связываются со специфическими сайтами активированных цитокиновых рецепторов через свой домен Sh3 и сами фосфорилируются, приводя к взаимному взаимодействию Sh3-pTyr между двумя молекулами Stat (Chen et al. 1998). Фосфорилированные Stats, следовательно, димеризуются, вытесняются из рецептора, перемещаются в ядро ​​и связываются со специфическими промоутеры.

    Есть также сходство в способе ингибирования сигнальных путей рецепторов RTK и TGFβ. Как отмечалось выше, RTK такие поскольку рецептор βPDGF может связывать Sh3-содержащий белок c-Cbl, который действует как белок-убиквитин-лигаза E3, чтобы маркировать рецептор деградации. В своей линкерной области Smads имеют мотивы, богатые пролином (PY), которые связывают WW-домены другого Белок-убиквитинлигаза E3 (Smurf) с каталитическим доменом Hect, приводящим к убиквитинизации и деструкции Smad (Zhu et al.1999). Таким образом, в обоих случаях модульные белковые взаимодействия нацелены на определенные компоненты сигнального пути для деградации, в мода, которая кажется критически важной для соответствующих биологических реакций.

    Передача сигналов рецептора TNF

    Члены семейства рецепторов фактора некроза опухоли (TNF) не имеют каталитических доменов, но используют специфические белок-белковые взаимодействия для передачи сигналов от рецептора к их нижележащим целям.Относительно простой пример включает рецептор Fas, который вызывает гибель клеток при стимуляции Fas-лигандом (Ashkenazi and Dixit 1998). Fas имеет карбокси-концевой домен смерти (DD), который специфически взаимодействует с родственным DD на карбоксильном конце адаптерный белок FADD (Chinnaiyan et al. 1995). FADD имеет аминоконцевой эффекторный домен смерти (DED), который, в свою очередь, распознает DED прокаспазы 8 (Muzio et al. 1996). Олигомеризация Fas с помощью Fas-L, по-видимому, сопоставляет цепи прокаспазы 8, которые, следовательно, подвергаются авторасщеплению, что приводит к к высвобождению активной каспазы 8, инициируя каскад протеолитических событий, которые приводят к апоптозу (Salvesen et al.1999). Таким образом, скорее как RTK, который задействует модульный белок (Grb2), который, в свою очередь, привлекает сигнальный фермент (Sos1) для активации путь Ras, поэтому Fas связывает модульный адаптер, FADD, который связывается с ферментом каспазой 8 и активирует апоптотический слиток. Эти данные показывают, что рецепторы, участвующие в сигнальных путях, которые не используют фосфорилирование в качестве основного механизма для передачи информации, тем не менее, используют модульные белок-белковые взаимодействия для специфической активации своих мишеней.

    Другие члены суперсемейства TNF-R, такие как TNF-R1, используют домен смерти для активации цитоплазматической передачи сигналов. TNF-R1 взаимодействует изначально с доменом смерти каркасного белка, называемого TRADD (Hsu et al. 1995), который, в свою очередь, распознает адаптер FADD, а также отдельный модульный белок, называемый TRAF2, который активирует Jnk MAPK путь, и DD-содержащая протеинкиназа RIP, которая стимулирует путь NFκB (Arch et al.1998) (рис.2). Таким образом, TNF-R1, как и некоторые RTK, использует стыковочный белок, который связывается с несколькими нижестоящими целями и, таким образом, может расширить диапазон и эффективность передачи сигналов рецепторами. Однако большинство членов семейства TNF-R, включая TNF-R2, по-видимому, сигнал в основном через белки TRAF. TRAF содержат карбокси-концевой домен (TRAF-C), который связывает короткие пептидные мотивы. на соответствующий рецептор или на стыковочные белки, такие как TRADD, которому предшествует область спиральной спирали.Аминоконцы TRAFs имеют кольцевые последовательности и последовательности цинковых пальцев, которые ответственны за взаимодействия с нижележащими мишенями (Rothe et al. 1994). Кристаллические структуры областей coiled-coil и TRAF-C TRAF2 указывают на то, что эти домены самоассоцируются с образованием тример, который идеально приспособлен для связывания активированного рецептора, который сам переводится в тримерное состояние своим лигандом (McWhirter et al. 1999; Park et al. 1999; Ye et al.1999). Таким образом, хотя TRAF имеют только низкое сродство к мономерному рецептору, они кооперативно связываются с олигомеризованными рецептор. Удивительно, но индивидуальный домен TRAF-C может связываться через ту же бороздку с пептидными мотивами, которые не связаны между собой. в их первичных последовательностях. Таким образом, по аналогии с доменами RTK и Sh3, олигомеризация TNF-R создает высокое сродство сайты связывания для доменов TRAF-C, которые распознают специфические мотивы внутри рецептора.TRAF затем действуют как адаптеры для связи активированные рецепторы к цитоплазматическим мишеням.

    Специфичность передачи сигналов серин / треонинкиназами

    RTK и другие рецепторы клеточной поверхности часто активируют протеин-серин / треониновые киназы, которые передают сигнал мишеням. в цитоплазме и ядре.Ясно, что это внутренняя функция рецепторов TGFβ, но другие рецепторы должны принимать более обходной путь стимуляции активности протеин-серин / треонинкиназы. Ras GTPase, активируемая RTK, связывает протеинкиназа c-Raf (киназа киназы MAPK или MAPKKK), которая, следовательно, фосфорилирует Mek (MAPKK). Mek имеет двойную специфичность киназа, которая фосфорилирует и активирует Erk (MAPK), которая имеет несколько субстратов, участвующих в регуляции роста клеток и распространение (Marshall 1994; Whitmarsh and Davis 2000).Подобные каскады протеинкиназ приводят к активации других MAPK, таких как Jnk / Sap или p38.

    RTK также могут стимулировать протеинкиназы серин / треонин через пути, включающие продукцию фосфолипидов, включая активация PI3K, что приводит к продукции PI-3,4,5-P3. PIP3 избирательно связывается с доменами PH серина / треонина. киназы PDK1 и Akt / PKB (Alessi et al.1997; Belham et al. 1999), вызывая их мембранную ассоциацию (Andjelkovic et al. 1999). Интересно, что PDK1 фосфорилирует PKB в петле активации каталитического домена способом, который необходим. для активации PKB и ее последующего воздействия на такие события, как выживаемость клеток. Кроме того, PDK1 представляется более общим активатор семейства серин / треониновых киназ, включая киназу p70S6, p90Rsk1 и изоформы атипичной протеинкиназы C (PKC), среди других.PLC-γ также регулирует передачу сигналов к PKC, стимулируя гидролиз PI-4,5-P 2 с образованием диациглицерина и IP 3 , которые способствуют активации обычных PKC.

    Посредством серии белок-белковых взаимодействий, частично описанных выше, TNF-R1 активирует гетеромерный комплекс, состоящий из двух субъединиц протеинкиназы, IKKα и IKKβ, и по крайней мере одного дополнительного компонента, IKKγ / Nemo (Rothwarf et al.1998; Карин 1999). Активация IKK приводит к фосфорилированию IκB, ингибитора фактора транскрипции NFκB, что приводит к протеолитическому образованию IκB. разрушение. Это освобождает NFκB для проникновения в ядро ​​и индукции экспрессии определенных генов.

    Возникает вопрос о том, что многочисленные рецепторы клеточной поверхности активируют пути с участием ряда протеин-серин / треониновых киназ. вопрос о том, как поддерживается специфичность в таких каскадах киназ, и как окончательное фосфорилирование целевых белков на серин / треонин изменяет их функциональные свойства.Поиски последнего вопроса открыли ряд модульных белки, которые физически распознают специфические фосфорилированные серин / треонин-содержащие мотивы, аналогично связывание доменов Sh3 или PTB с pTyr-содержащими белками. Белки 14-3-3 обеспечивают прототип этой идеи. Млекопитающее клетки содержат семь изоформ 14-3-3, которые образуют гомо- или гетеродимеры, распознающие специфические мотивы, содержащие pSer, первоначально идентифицировано как имеющее консенсус Arg-Ser-X-pSer-X-Pro (Muslin et al.1996). Более свежие данные выявили структурную основу этого взаимодействия (Yaffe et al. 1997). Особый интерес представляет то, что некоторые из белков, участвующих в упомянутых выше сигнальных путях, связаны с белками 14-3-3. после их фосфорилирования. Протеинкиназа PKB, например, фосфорилирует проапоптотические белки BAD и FKHRL1, первый является членом семейства Bcl, который в своем нефосфорилированном состоянии связывает и ингибирует антагонист смерти Bcl-X L (Zha et al.1996), тогда как FKHRL1 является фактором транскрипции, который может индуцировать экспрессию проапоптотических генов (Brunet et al. 1999). Связывание белков 14-3-3 с фосфорилированными мишенями, по-видимому, приводит к их перемещению и ингибированию. В в случае BAD это достигается за счет его отделения от Bcl-X L , в то время как FKHRL1, по-видимому, сохраняется в цитоплазме после образования комплекса с 14-3-3 и, следовательно, не может получить доступ к его мишеням в ядре.Белки 14-3-3 также взаимодействуют с киназой c-Raf для регулирования ее активности (Thorson et al. 1998), и действительно, доминантный отрицательный белок 14-3-3 блокирует индуцированную сывороткой активацию Erk MAPK и усиливает апоптоз как в культивируемых клетки и у мышей (Xing et al. 2000).

    Способность белков 14-3-3 контролировать клеточные события посредством распознавания конкретных фосфопротеинов не ограничена. к обычным сигнальным путям, реагирующим на внешние сигналы, но также важен для регулирования контрольных точек в клетке цикл, который отслеживает внутренние события, такие как повреждение ДНК.В этом контексте ключевой шаг в контроле прохождения млекопитающих клетки через клеточный цикл - это фосфорилирование серина Cdc25C, тирозинфосфатазы, которая дефосфорилирует и активирует критическая регулируемая циклином протеинкиназа Cdc2 и тем самым способствует переходу клетки в митоз. Во время интерфазы Cdc25C фосфорилируется по Ser-216, что приводит к связыванию с белками 14-3-3 (Peng et al. 1997). Cdc25C перемещается между цитоплазмой и ядром, а связывание 14-3-3 способствует удержанию Cdc25C в цитоплазме, возможно, за счет маскировки сигнала ядерной локализации (рис.4). В результате Cdc25C физически отделяется от своего ядерного субстрата, который поэтому находится в неактивном состоянии. Дефосфорилирование Ser-216 высвобождает Cdc25C для проникновения в ядро ​​и инициации митоза. В дрожжах протеинкиназы, регулирующие контрольные точки клеточного цикла. реагируя на повреждение ДНК и блоки репликации, такие как Cds1 и Chk1, непосредственно фосфорилируют Cdc25 и индуцируют Cdc25 / 14-3-3 комплекс, тем самым замедляя прохождение клеточного цикла и давая время на восстановление ДНК (Zeng et al.1998; Zeng and Piwnica-Worms 1999).

    Рисунок 4.

    Упрощенная схема, показывающая роль событий фосфорилирования серина / треонина в регуляции клеточного цикла, вызванного повреждением ДНК. контрольно-пропускной пункт. Повреждение ДНК приводит к опосредованной фосфорилированием стабилизации p53 различными киназами (ATM, ATR, ДНК-PK, Jnk и CKI).Это блокирует взаимодействие p53 с Mdm2, что обычно приводит к эффективному нацеливанию на убиквитин. деградация p53 протеасомой. Активированный p53 индуцирует транскрипцию таких генов, как p21Cip / Waf, циклинзависимый ингибитор киназы, который блокирует действие CyclinE / Cdk2 и тем самым предотвращает фосфорилирование таких мишеней, как Rb, событие, необходимое для перехода с G 1 на S. Таким образом, стабилизация повреждений ДНК р53 блокирует развитие клеточного цикла в контрольной точке G 1 -to-S.Циклин E1 сам разлагается на границе G 1 -to-S после фосфорилирования на Thr-380. Фосфорилирования в этом сайте достаточно для нацеливания Cyclin E1 на Убиквитинлигазный комплекс SCF E3, состоящий из Cdc53 / CUL-1, Skp1, Rbx-1, Cdc34 (E2) и предполагаемого белка F-бокса. Повреждение ДНК также приводит к активации киназы Chk1, которая фосфорилирует фосфатазу Cdc25C на Ser-216. 14-3-3 связывает белок фосфорилирует Cdc25C и изолирует этот комплекс в цитоплазме.Для активации CyclinB / Cdk2 требуется активный Cdc25C. для перехода из G 2 в M. Таким образом, повреждение ДНК также блокирует развитие клеточного цикла в контрольной точке G 2 -to-M.

    Белки 14-3-3 представляют собой небольшие индивидуальные полипептиды, которые еще не были обнаружены ковалентно связанными с другими функциональными группами. домены.Однако существуют белковые модули с потенциалом связывания мотивов, содержащих pSer / pThr, которые, как и домены Sh3, расположены внутри ряда различных белков-хозяев. Примечательно, что домен Forkhead-associated (FHA) присутствует в широком ряд ядерных полипептидов, участвующих в транскрипции, репарации ДНК или прогрессировании клеточного цикла как у эукариот, так и у прокариот (Хофманн и Батчер, 1995). Недавняя работа с дрожжевой протеинкиназой Rad53 показала, что ее аминоконцевой домен FHA избирательно связывается с pThr-X-X-Asp. мотивов и предположил, что распознавание фосфорилированных пептидных мотивов может быть общим свойством доменов FHA (Durocher et al.1999). Структура карбоксиконцевого домена PHA Rad53 была недавно решена, и был обнаружен β-сэндвич с двумя антипараллельными β-листы (Liao et al. 1999), но точный механизм связывания лиганда неизвестен. Интересно, что Rad53 находится ниже своего фосфорилированного связывания. партнер, Rad9, белок, который ощущает повреждение ДНК, что позволяет предположить, что важно фосфозависимое FHA-опосредованное взаимодействие в сигнализации контрольно-пропускных пунктов (Sun et al.1998). В соответствии с этой идеей, недавние данные показывают, что аминоконцевой домен FHA человеческого Chk2, гомолог дрожжевого Rad53, подвержен мутациям при синдроме семейного рака Ли-Фраумени (Bell et al. 1999).

    Появляется все больше примеров pSer / pThr-зависимых белок-белковых взаимодействий. Фосфорилирование фактора транскрипции CREB на Ser-133 протеинкиназами, такими как цАМФ-зависимая протеинкиназа (PKA), PKB и p90Rsk2, создает сайт связывания для коактиватор CBP, и приводит к транскрипционной активации CREB-чувствительных генов (Xing et al.1996; Радхакришнан и др. 1997; Du and Montminy 1998). Точно так же домен WW пептидил-пролилизомеразы Pin1 связывает мотивы pSer-Pro, которые могут позиционировать фермент близко к к его субстратам (Лу и др., 1999).

    Не менее поразительно то, что pSer / Thr-зависимое распознавание белков членами семейства F-боксов, по-видимому, является обычным и распространенным явлением. критический механизм для избирательного разрушения сигнальных белков и белков клеточного цикла с помощью убиквитин-опосредованного протеолиза (Craig and Tyers 1999; Tyers and Willems 1999).Эта схема была впервые разработана для комплекса белков (называемых SCF), которые контролируют прогрессирование S-фазы у Saccharomyces cerevisiae, благодаря их способности разрушать их мишени таким образом, который наводит порядок в клеточном цикле (Willems et al. 1997; Паттон и др. 1998). В дрожжах белок, названный Cdc53 (соответствующий белкам многоклеточных организмов), служит каркасом для набора адаптер (Skp1), белок-убиквитинлигаза E2 (Cdc34) и белок безымянного пальца (Rbx1), который усиливает убиквитинирование субстрата.Skp1 связывает комплекс Cdc53 с одним из многих белков с консервативным Skp1-связывающим доменом, называемым F-боксом. Белки F-бокса содержат одноименный F-бокс на амино-конце и вариабельный карбоксильный конец, обычно состоящий из повторов WD40 или богатые лейцином повторы, которые напрямую связываются с мишенью для убиквитинирования. В некоторых случаях фосфорилирование мишени требуется для его ассоциации с белком F-бокса.Это было хорошо продемонстрировано для дрожжевого белка Sic1, который является единственной важной мишенью для активности Cdk во время фазы G 1 клеточного цикла. Sic1 является ингибитором комплекса Cdk фазы G 2 / M, и его инактивация путем протеолитической деградации необходима для прохождения через клеточный цикл. Sic1 фосфорилируется по нескольким сериновым остаткам и впоследствии связывается с карбоксиконцевыми повторами WD40 Белок F-бокса, названный Cdc4, приводит к его деградации.Нацеливание на конкретные белки для деградации за счет их ассоциация с F-box белками, вероятно, регулирует многие события в передаче сигналов (Fig. 4). Например, фосфорилированный IκB распознается βTrCP, белком F-бокса млекопитающих с карбоксиконцевыми повторами WD40, это тесно связано с дрожжевым Cdc4 (Yaron et al. 1998; Winston et al. 1999). Таким образом, ключевым событием в передаче сигналов TNF-R является фосфо-зависимое распознавание ингибитора IκB белком F-бокса.

    Взаимодействие с каркасами и стыковкой в ​​путях протеин-серин / треонинкиназ

    Обобщенные выше данные показали, что фосфорилирование остатков серина / треонина напрямую регулирует белок-белковый взаимодействия. Многие из сигнальных путей, которые контролируют фосфорилирование серина / треонина, состоят из последовательности протеинкиназ (например, каскады MAPK), поднимая вопрос о том, как специфичность сохраняется в таких обстоятельствах.Ясно, что протеин-серин / треонинкиназы предпочтительно фосфорилируют определенные мотивы в своих субстратах, но опыт с тирозинкиназами предполагает, что они могут иметь более обширные взаимодействия со своими мишенями. Действительно, два типа стыковки взаимодействия, по-видимому, важны для определения специфичности передачи сигналов pSer / Thr. Протеинкиназы часто прикреплены к каркасу. белок, который может либо облегчить поток информации от одной киназы к другой, либо удерживать киназу в латентном состоянии близко к рецептору, который будет вызывать его активацию (Pawson and Scott 1997; Whitmarsh and Davis 1998).Кроме того, MAPK, по-видимому, имеют специфические стыковочные взаимодействия со своими непосредственными субстратами и регуляторами, которые, вероятно, повышают специфичность путей MAPK (Holland and Cooper 1999) (рис. 5).

    Рисунок 5.

    Опосредованная каркасом сборка сигнальных путей. (A) Jip1 действует как каркас для каскада Jnk MAPK млекопитающих.Jip1 имеет отдельные сайты связывания для Jnk и вышестоящих киназ. MKK7 ​​(MAPKK), MLK3 (MAPK) и HPK1. Jip1 также имеет домены Sh4 и PTB, которые могут связывать комплекс с дополнительными белками. участвует в восходящей активации или локализации. (B) Erk MAPK стыкуется с белками-мишенями. Привязанный таким образом Erk фосфорилирует субстрат Rsk1. (C) Регуляторная субъединица циклина A Cdk2 связывает субстраты с консервативным мотивом RXL, таким как p107.(D) Белок Yotiao AKAP связывается с рецептором NMDA, PKA в неактивной форме и PP1 в активной форме. При этом Ётяо создает тесную физическую ассоциацию компонентов, которые подавляют рецептор NMDA в покое и усиливают активацию канала.

    Классическим примером этого последнего типа каркасного белка является полипептид Ste5 в дрожжах, который необходим для роста арест и спаривание, и действует ниже рецептора феромона, связанного с G-белком, чтобы регулировать каскад MAPK (Elion 1998).Ste5 взаимодействует с субъединицей Gβ (Ste4) (Pryciak and Huntress 1998) и имеет независимые сайты связывания для MAPKKK (Ste11), MAPKK (Ste7) и MAPK (Fus3) (Choi et al. 1994). Для Ste5 были предложены различные функции, в частности, для повышения точности пути путем физического сопоставления последовательных киназ, чтобы локализовать эти киназы в определенных субклеточных компартментах и ​​изолировать взаимодействующие киназы от отдельные дорожки. Также возможно, что олигомеризация Ste5 может усиливать активацию киназы, способствуя межмолекулярной аутофосфорилирование.Потенциальная важность каркасных белков подчеркивается наблюдением, что MAPKKK Ste11 также действует в пути осмосенсибилизации дрожжей, хотя другие компоненты пути, включая Hog1 MAPK, различны. В этом случае MAPKK Pbs2 обеспечивает функцию каркаса через удлиненный аминоконце. Pbs2 задействует оба Ste11 и Hog1, а также рецептор осмосенсибилизации (Sho1), который имеет домен Sh4, который связывает богатый пролином мотив в Pbs2 (Posas and Saito 1997).Таким образом, Pbs2 выполняет несколько аналогичную функцию Ste5 в сборке элементов сигнального пути в индивидуум. сложный.

    Недавние данные предполагают, что каркасные белки, родственные Ste5, вероятно, играют важную роль в организации MAPKs у млекопитающих. клетки. В частности, было идентифицировано несколько белков, которые связывают участников пути Jnk MAPK и усиливают активацию Jnk. (Ясуда и др.1999; Келкар и др. 2000). JIP1 и JIP2 - это близкородственные белки, которые имеют отдельные сайты связывания для Jnk и вышестоящих киназ MKK7 (MAPKK), MLK3 (MAPKKK) и HPK1, киназа, родственная Ste20, которая активирует MLK3 (фиг. 5A). JIP1 / 2, по-видимому, являются активаторами передачи сигналов Jnk и могут образовывать большие цитоплазматические комплексы благодаря своей способности производить гомо- или гетероолигомеры. Они относительно избирательны в отношении определенных членов сигнальной кассеты Jnk, что позволяет предположить, что они служат как для усиления активации, так и для придания специфичности.Интересно, что эти белки JIP имеют на карбокси-конце Sh4 и домены PTB, которые могут способствовать их локализации или ассоциации с другими сигнальными белками. Действительно, ПТБ JIP-1 домен связывает RhoGEF, а JIP-1 локализуется на концах нейритов в культивируемых нейрональных клетках (Meyer et al. 1999).

    В дополнение к косвенной ассоциации MAPK и их вышестоящих регуляторов, опосредованной их общим взаимодействием с Один и тот же каркасный белок, MAPK могут напрямую связываться со своими субстратами и регуляторами через некаталитические сайты стыковки.Как и другие протеинкиназы, MAPK Erk и Jnk предпочтительно фосфорилируют серин или треонин в соответствии с определенным консенсусом. последовательность, минимально Ser / Thr – Pro. Однако это не полностью объясняет специфичность выбора субстрата MAPK in vivo. Скорее, похоже, что физиологические субстраты для MAPK имеют отдельные мотивы, которые связывают фермент с его фосфорилированием. цель. Обычный сайт стыковки Erk MAPK образован коротким отрезком основных остатков, обнаруженных в субстратах, таких как протеинкиназы Rsk1 / 2 и Mnk2, и заметно увеличивает эффективность их фосфорилирования (Waskiewicz et al.1997; Гэвин и Небреда 1999). Докинг-мотив связывает отрицательно заряженную карбокси-концевую область с каталитическим доменом Erk. Примечательно то же самое основной мотив обнаружен в киназе (Mek) и фосфатазе (MKP), которые соответственно фосфорилируют и дефосфорилируют Erk, что позволяет предположить что субстраты и регуляторы могут конкурировать за один и тот же сайт связывания на протеинкиназе Erk (Tanoue et al. 2000). Аналогичный общий стыковочный домен (CD) находится в членах семейств Jnk и p38 MAPK, а также, по-видимому, определяет взаимодействия. с подложками и регуляторами.Отдельный сайт стыковки (FXFP) обнаружен в субстратах Erk, таких как транскрипция Elk-1. фактора, и его присутствие заметно увеличивает сродство, с которым взаимодействуют киназа и субстрат, что приводит к усилению фосфорилирование (Jacobs et al. 1999). Elk-1 имеет дополнительный мотив стыковки, блок D, который связывается как с Erk, так и с Jnk, и связан с доменом δ в c-Jun. что дает высокую аффинность связывания с Jnk. Интересно, что эти мотивы переносимы в том смысле, что они преобразуют плохая мишень в высокоаффинный субстрат для релевантной MAPK, и действуют синергетически, усиливая фосфорилирование.

    Результаты этого типа показали, что MAPK и, возможно, многие другие серин / треониновые киназы выбирают свои субстраты. сначала посредством некаталитического стыковочного взаимодействия, которое определяет фосфорилирование субстрата. Далее следует распознавание специфического сайта в связанном белке для фосфорилирования в активном сайте фермента (рис. 5B). Действительно, регуляторная субъединица циклина A в Cdk2 связывает субстраты с консервативным мотивом RXL, таким как p107, способом это важно для их последующего фосфорилирования (Schulman et al.1998) (рис. 5C). Сходным образом, специфические циклины в дрожжах (Pcl8 / Pcl10) направляют Pho85 Cdk на фосфорилирование гликогенсинтазы и тем самым противодействуют накоплению гликогена (Huang et al. 1998). В принципе, эти механизмы, посредством которых протеин серин / треонинкиназы увеличивают локальную концентрацию своих Физиологические субстраты очень похожи на устройства, с помощью которых тирозинкиназы привлекают свои мишени. Таким образом, получается что стыковочные взаимодействия такого рода могут быть очень общим явлением при распознавании субстратов протеинкиназы и поэтому в определении специфичности передачи сигнала.

    Способность скаффолдинговых белков организовывать протеинкиназы и фосфатазы, регулирующие фосфорилирование серина / треонина типичными являются заякоренные белки А-киназы (AKAP) (Colledge and Scott 1999). Они представляют собой растущее семейство больших полипептидов, которые содержат сайты связывания для различных белков серина / треонина. киназы и фосфатазы, а также целевой мотив, который направляет полученный комплекс в конкретный сайт в клетке.PKA имеет каталитическую субъединицу (C), активность которой подавляется связыванием с регуляторной субъединицей (R). Рецепторы, такие как GPCR повысить уровень цАМФ, который связывается с субъединицей R и вызывает диссоциацию свободной субъединицы C. В дополнение к его связыванию с цАМФ сайтов, субъединицы R имеют аминоконцевой домен, необходимый для димеризации и связывания с AKAP. В случае Субъединица RII, димеризованный амино-конец образует пучок из четырех спиралей, который создает бороздку для размещения амфипатической α-спирали. из AKAP (Newlon et al.1999). Таким образом, короткий мотив на AKAP связывает субъединицу RII PKA, удерживая киназу в неактивном состоянии в субклеточном сайте. продиктовано AKAP. AKAP связываются не только с PKA, но и с другими протеинкиназами, такими как изоформы PKC, а также с серином / треонином. фосфатазы (PPI и PPII). В целом, AKAP, по-видимому, закрепляют киназы и фосфатазы в неактивном состоянии, закрывая к их активаторам и субстратам. Yotiao представляет собой белок массой ~ 210 кДа, который напрямую взаимодействует с субъединицей NR1A NMDA. рецептор и связывает как субъединицу RII PKA в неактивном состоянии, так и фосфатазу PP1 в активной форме (Westphal et al.1999). Активность канала рецептора NMDA положительно регулируется фосфорилированием и физическим связыванием конститутивно активных фосфатаза к NR1A, Yotiao, по-видимому, подавляет активность канала в условиях покоя. Однако одновременное соседство неактивной PKA с рецептором означает, что Yatiao также усиливает активацию канала, как только цАМФ высвобождает активная субъединица С, преодолевая ингибирующую активность фосфатазы (рис.5D). Таким образом, белок-белковые взаимодействия, по-видимому, являются важной детерминантой специфичности передачи сигналов нейротрансмиттером. рецепторы. Эта тема была поддержана открытием сложной сети взаимодействующих белков в постсинаптическом плотность, которая в значительной степени за счет взаимодействий, опосредованных доменом PDZ, по-видимому, организует локализацию и сигнальную активность рецепторов глутамата и GPCR (Fanning and Anderson 1999; Tu et al.1999).

    Направляющие рецепторы и передача сигналов к цитоскелету

    При рассмотрении сигнальных путей обычно останавливаются на событиях, которые достигают высшей точки в ядре. Однако сигнальные пути которые контролируют цитоскелет и адгезию клеток к внеклеточному матриксу, необходимы для направляемой миграции клеток, в том числе такие процессы, как наведение аксонов и формирование топографической карты в головном мозге.Недавняя работа определила ряд клеточных поверхностей. рецепторы, которые опосредуют ответы аксонов как на отталкивающие, так и на сигналы притяжения, и которые играют большую роль в управляемых движение нескольких типов клеток (Tessier-Lavigne and Goodman 1996). Среди этих рецепторов наведения есть члены семейства RTK Eph. Рецепторы Eph млекопитающих взаимодействуют с лигандами, называемыми эфрины, которые сами заякорены на поверхности клетки либо через GPI-связь (эфрины A-типа), либо через трансмембранную последовательность, присоединенная к консервативному цитоплазматическому хвосту (эфрины B-типа) (Holder and Klein 1999).Физиологическая активация рецептора Eph, по-видимому, требует прямого взаимодействия между рецептором и клетками, экспрессирующими эфрин. После активации рецепторы Eph подвергаются аутофосфорилированию в нескольких сайтах, включая петлю активации киназного домена. и по остаткам тирозина в консервативном мотиве в прилегающей мембранной области (Kalo and Pasquale 1999). Удивительно, но сайты аутофосфорилирования юкстамембранной мембраны, по-видимому, выполняют двойную функцию, поскольку они вносят вклад в рецепторную активация киназы, а также обеспечение сайтов стыковки белков с доменами Sh3 (Holland et al.1997; Binns et al. 2000; Zisch et al. 2000). Помимо непосредственного связывания белков Sh3, рецепторы Eph могут фосфорилировать стыковочные белки, такие как p62 dok , который задействует Ras GAP и Nck адаптера Sh3 / Sh4 посредством Sh3-опосредованных взаимодействий (Holland et al. 1997).

    Рецепторы

    Eph выполняют множество функций у позвоночных и беспозвоночных, включая регуляцию ангиогенеза, образование границы между ромбомерами, формирование неба и морфогенез тканей.Однако наиболее интенсивно они изучены на предмет их роли в ведении аксонов и формировании топографических карт в центральной нервной системе (Flanagan and Vanderhaeghen 1998). Связывание эфринов с нейронными клетками, экспрессирующими рецепторы Eph, вызывает ремоделирование актинового цитоскелета и рост коллапс коллапса способом, который зависит от активности рецепторной киназы и соседних сайтов pTyr (Drescher et al. 1995; Binns et al. 2000). Эти данные предполагают, что активированные рецепторы Eph могут связываться с сигнальными белками, которые регулируют цитоскелет.Есть несколько кандидатов, которые могут выполнять эту роль, включая адаптер Nck.

    Nck имеет карбокси-концевой домен Sh3, который связывает сайты pTyr, и три аминоконцевых домена Sh4, которые задействуют различные белки, участвующие в организации цитоскелета (Buday 1999). В частности, второй домен Sh4 Nck связывает белок серин / треонинкиназу Pak (Bokoch et al. 1996; Lu et al.1997) (рис.6). Pak имеет карбокси-концевой домен киназы и удлиненный амино-конец, который связывает домены Sh4 как Nck, так и Rac / Cdc42. GEF назвал PIX (Manser et al. 1998), а также узнал GTP-связанные Rac / Cdc42 GTPases. Nck рекрутирует Pak к мембране, тогда как связывается Cdc42. для прямого увеличения активности Pak киназы, вероятно, вызывая конформационное изменение, которое высвобождает ингибирующий эффект амино-конец.Таким образом, Pak может иметь два способа модификации актинового цитоскелета. Один из них - киназозависимый эффект через фосфорилирование субстратов, таких как киназа легкой цепи миозина (Sanders et al. 1999), тогда как взаимодействие с PIX может доставлять независимый от киназы сигнал посредством активации Cdc42 / Rac (Рис. 6).

    Рисунок 6.

    Сигнальный путь к цитоскелету.Рецепторы наведения аксонов потенциально связывают адаптер Nck через Sh3- и Sh4-опосредованные взаимодействия. Второй домен Sh4 Nck рекрутирует серин / треонинкиназу Pak на мембрану. Пак киназная активность индуцируется связыванием GTP-Cdc42 с мотивом CRIB. Pak также может генерировать активированный Cdc42 через связанный PIX GEF. (Pro, мотив, богатый пролином).

    Генетические данные Drosophila подтверждают идею, что Nck и Pak важны для контроля управления аксонами.Мутации в гомологе Drosophila Nck (называемые дредами или доками) вызывают поразительные дефекты в наведении и нацеливании аксонов фоторецепторов, и это аберрантное поведение имитируется мутациями у Drosophila Pak (Hing et al. 1999). Интересно, что мутации в сайтах связывания Cdc42 и Nck нарушают способность Pak правильно управлять аксонами. Такой данные свидетельствуют о том, что модульные белки, идентифицированные в других сигнальных путях, играют важную роль в связывании рецепторы клеточной поверхности к актиновому цитоскелету и, таким образом, к контролю управляемого клеточного движения.Действительно, растет количество таких примеров.

    Два сигнальных белка, по-видимому, имеют центральное значение для контроля цитоскелета и могут служить точками конвергенции ниже по течению от множество рецепторов наведения (рис. 7). Белок DrosophilaEnabled (Ena) и его гомолог Mena у млекопитающих принимают непосредственное участие в регуляции динамики актина (Lanier and Gertler 2000). Mena имеет аминоконцевой домен EVh2, который взаимодействует с белками, входящими в состав фокальных комплексов, такими как винкулин и зиксин, с белком ActA бактериального патогена Listeria monocytogenes и рецептором наведения Roundabout (Robo) (Gertler et al.1996; Prehoda et al. 1999). Центральная область Mena имеет богатые пролином мотивы, которые связаны с профилином, связывающим актин / фосфолипид-связывающий белок, и с белками, которые обладают доменами Sh4 или WW. На своем карбоксильном конце Mena имеет домен EVh3, участвующий в димеризации. и связь с актином. Таким образом, Mena потенциально может связывать белки с мотивами E / DFPPPP, которые связывают домен EVh2 для регуляции. актинового цитоскелета (Lanier et al.1999). Др. Многодоменный белок, который действует в нейронах для контроля наведения аксонов, - это UNC-73 (Steven et al. 1998), аналог C. elegans Trio млекопитающих (Debant et al. 1996). В то время как UNC-73 и Trio различаются по своим крайним карбоксильным концам, у них обоих есть аминоконцевой домен, обнаруженный в белках. такие как дрожжевой Sec14, который связывает фосфатидилинозитол, за которым следуют несколько спектриновых повторов и домен DH-PH, который служит как GEF для Rac GTPase. Эта область соединяется доменом Sh4 со вторым доменом DH-PH, который обладает активностью Rho GEF.Структура UNC-73 / Trio предполагает, что он может связывать сигналы с регуляцией GTPases семейства Rho и, таким образом, с реорганизацией цитоскелета. Действительно, мутации с потерей функции в unc-73 вызывают множество дефектов в управляемых клеточных движениях и замену в первом домене DH, которая ингибирует его активность Rac GEF. нарушает ведение аксонов (рис. 7). Задача на будущее будет заключаться в том, чтобы разобраться, как рецепторы наведения клеточной поверхности взаимодействуют с цитоплазматической передачей сигналов. молекулы, такие как Mena и Unc-73 / Trio.Некоторые подсказки можно получить, рассмотрев серию новых рецепторов наведения, чьи связи внутриклеточные пути в настоящее время загадочны.

    Рисунок 7.

    Модульные белки, которые могут интегрировать передачу сигналов цитоскелета. Mena взаимодействует с рецепторами, компонентами очаговой адгезии и бактериальных патогенов через домен EVh2 и имеет несколько мотивов, которые потенциально связаны с актиновым цитоскелетом.UNC-73 / Трио имеет аминоконцевой домен, связанный с дрожжевым Sec 14, множественные спектриновые повторы и два домена DH-PH, которые активируют Rac и Ро соответственно. Сигнальные пути, которые лежат выше UNC-73 / Trio, не установлены.

    Рецептор Robo1 у дрозофилы связывает репеллент средней линии Slit и, следовательно, предотвращает пересечение (или обратное пересечение) аксонов средней линии (Kidd et al.1998, 1999; Brose et al. 1999). Цитоплазматическая область Робо имеет ряд богатых пролином мотивов, которые сохраняются в процессе эволюции, и, как отмечалось выше, потенциально могут взаимодействовать с доменом Mena EVh2, а также с Sh4-содержащими белками. Таким образом, вполне вероятно, что Робо влияет на цитоскелет через модульные белки, способные связывать определенные богатые пролином последовательности.

    Белок UNC-5, консервативный от C.elegans на млекопитающих, реагирует на внеклеточный лиганд нетрин и оказывает отталкивающее действие на конус роста (Leuing-Hagesteijn et al. 1992; Leonardo et al. 1997), обычно в сочетании с совершенно другим рецептором нетрина, UNC-40 / DCC (Чан и др., 1996). Примечательно, что нетрин оказывает привлекательное действие на аксоны, которые экспрессируют только UNC-40 / DCC, который превращается в отталкивающий эффект на экспрессию UNC-5 и его связь с UNC-40 / DCC (Hong et al. 1999). Механизмы передачи сигналов UNC-5 и UNC-40 в настоящее время неизвестны, но их цитоплазматические области, по-видимому, имеют модульную структуру. строительство.UNC-5 имеет карбокси-концевой домен гибели, хотя эти швы не нужны для управления аксонами, и центральный область также обнаружена в белке соединения клеток ZO-1 и белке цитоскелета анкирин. Кроме того, UNC-5 и UNC-40 / DCC напрямую взаимодействуют друг с другом через свои цитоплазматические области. Открытие того, что рецепторы наведения действуют совершенно по-другому. эффекты в зависимости от их ассоциации с корецептором или после повышения цАМФ или цГМФ (Song et al.1998), добавляет увлекательную сложность, которую еще предстоит изучить на биохимическом уровне. Подобно UNC-5, плексины, которые действуют как рецепторы для направляющих молекул семафорина, имеют консервативные цитоплазматические домены, биохимическая активность которых неизвестно (Tamagnone et al. 1999). Выяснение сигнальных путей, активируемых этими разнообразными рецепторами, будет важно для понимания сложности движения клеток и образование сложных тканей, таких как мозг.

    Интеграция сигнальных путей

    В организме клетка будет одновременно подвергаться воздействию множества потенциально противоречивых сигналов в виде растворимых гормоны и лиганды, прикрепленные к соседним клеткам или ECM. Клетка должна иметь механизмы для преобразования этих различных сигналов. в определенный ответ.Кроме того, клетка должна контролировать свое внутреннее состояние, чтобы не пытаться делиться раньше. достижение соответствующей массы, например. Есть некоторые подсказки относительно того, как можно достичь этих типов регулирования. В Один из способов интеграции, активация ключевого сигнального белка требует ввода от двух или более различных биохимических путей. Такое поведение проявляет протеин-серин / треонинкиназы Rsk1. Rsk1 имеет два каталитических домена, из которых аминоконцевой домен фосфорилирует нижестоящие мишени.Аминоконцевой домен киназы контролируется несколькими входами, включая карбокси-концевой домен. Erk MAPK связывает основной сайт стыковки на крайнем карбоксильном конце Rsk1 и фосфорилирует сайты в линкерной области между двумя киназными доменами и в карбоксиконцевом домене, которые необходимы для активации. Однако полная активация также требует фосфорилирования амино-концевого домена киназы PIP 3 -зависимой протеинкиназой PDK1 (Nebreda and Gavin 1999; Richards et al.1999). Активация Rsk1, следовательно, требует входов как от пути Erk MAPK, так и от пути PI3K (Fig. 8A).

    Рисунок 8.

    Интеграция сигнальных путей. (A) Активация Rsk1 требует фосфорилирования как PDK1, так и ERK MAPK. Таким образом, пути PI3K и Ras синергизируют, чтобы стимулировать протеин-серин / треониновая киназа Rsk1.(B) Передача сигналов через путь рецептора интерферона (IFN) γ-Stat3 индуцирует экспрессию ингибирующего Smad7, который блокирует активность рецептора TGFβ. Таким образом, один цитокиновый путь ингибирует активацию отдельного пути. (C) И рецептор Wnt (DFz2), и связанный с ним сигнал Frizzled через мультидоменный белок Disheveled. Wnt сигнализация вовлекает DIX и PDZ домены Disheveled, которые активируют путь β-catenin.Завитые сигналы через карбокси-терминал DEP для активации пути JNK MAPK.

    Очевидно, большая часть интеграции сигнальных путей происходит на уровне промоторов транскрипции. Таким образом, транскрипция факторы, регулируемые сигнальными путями TGFβ и Wnt (Smads и β-катенин в комплексе с Lef1 / Tcf, соответственно) могут физически взаимодействуют друг с другом и синергетически активируют экспрессию генов во время эмбрионального развития (Nishita et al.2000).

    Альтернативный сценарий состоит в том, что два разных пути имеют противоположные эффекты, и поэтому клетка может захотеть предотвратить их одновременная активация. Процесс такого рода наблюдается для передачи сигналов с рецептором интерферона-γ, который через активацию фактора транскрипции Stat3, индуцирует экспрессию Smad7 (Ulloa et al. 1999). Smad7 ингибирует передачу сигналов рецептора TGFβ, поскольку он связывает активированный рецептор, но не имеет сайтов фосфорилирования и не задействовать обычный Smad4.Таким образом, передача сигналов цитокинов не только активирует специфический клеточный ответ, но и нарушает клеточную способность реагировать на конфликтный сигнал (рис. 8Б). Связанный эффект был предложен для пути Erk MAPK, поскольку Erk фосфорилирует Smad2 / 3 в линкерной области между домены Mh2 и Mh3, тем самым очевидно отравляя удержание Smad в ядре и блокируя передачу сигналов TGFβ (Kretzschmar et al. 1999).

    Дополнительный поворот заключается в том, что отдельный сигнальный белок может регулировать передачу сигналов через несколько различных путей, как по-видимому, так обстоит дело с модульным цитоплазматическим белком Disheveled (Dsh) (Cadigan and Nusse 1996).Dsh имеет амино-концевой домен DIX, который он разделяет с аксином белка, центральный домен PDZ и карбокси-концевой Домен DEP, модуль, обнаруженный в различных сигнальных белках, в частности, белках, участвующих в регуляции передачи сигналов G-белка, но в настоящее время функции неизвестны. Dsh играет ключевую роль в передаче сигналов от рецепторов Wnt (таких как DFz2 у Drosophila) в комплекс, состоящий из аксина / кондуктина, протеинкиназы GSK3β, β-катенина и APC (Zeng et al.1997; Behrens et al. 1998; Fagotto et al. 1999). Эта активность Dsh требует аминоконцевых доменов DIX и PDZ и, вероятно, включает прямое взаимодействие с DIX домен аксина (Itoh et al. 2000). В отсутствие передачи сигналов Wnt фосфорилирование β-катенина GSK3β создает сайты узнавания для белка F-бокса. βTrCP, приводящий к убиквитинированию и деградации β-catenin (Hart et al. 1999). После стимуляции Wnt Dsh ингибирует фосфорилирование β-катенина, возможно, вытесняя GSK3β из комплекса, и накопление β-катенина перемещается в ядро, где он активирует экспрессию гена в комплексе с транскрипцией Lef1 / Tcf фактор (Behrens et al.1996). Dsh, однако, выполняет совершенно иную роль ниже рецептора Drosophila Frizzled, который контролирует плоскую полярность эпителия. Этот сигнальный путь опосредуется его карбокси-концом. DEP домен, который приводит к активации пути Jnk (Boutros et al. 1998) (Fig. 8C).

    Эволюция сигнальных путей

    Можно задаться вопросом, почему клетка так широко использовала модульные домены и переносимые мотивы распознавания для организации сигналов. трансдукция.Вероятное объяснение состоит в том, что это позволяет быстро эволюционировать новым сигнальным путям с помощью простых устройство объединения существующих доменов вместе в новых комбинациях, и позволяя вариациям в интерфейсах связывания генерировать новые особенности. Например, после того, как клетка сгенерировала домен Sh3 со способностью распознавать мотив pTyr, как по-видимому, произошло очень рано в эволюции многоклеточных животных (Kawata et al.1997), в ячейке есть портативный модуль, который можно дублировать и вставлять в уже существующие ферменты или адаптеры для их воспроизведения. реагирует на передачу сигналов тирозинкиназы. Тогда простая мутация могла бы генерировать домены Sh3 с новыми свойствами распознавания (как может быть достигнуто in vitro), позволяя рецепторам избирательно взаимодействовать с подмножеством цитоплазматических мишеней. Хотя дрожжи не имеют обычных тирозинкиназ и функциональных доменов Sh3, но, тем не менее, имеют много белковых модулей, Sh4 и EH домены среди других, которые регулируют такие события, как эндоцитоз, перенос пузырьков и организация цитоскелета (Tang et al.2000). Последующее появление доменов Sh3, по-видимому, позволило клетке присоединить этот недавно созданный модуль к уже существующим. Sh4-домены, тем самым создавая новые адаптерные белки, которые связывают передачу сигналов pTyr с мишенями с богатыми пролином Sh4-связывающими мотивами. Неоднократное использование ограниченного числа белковых модулей также позволяет эволюционировать сети взаимодействующих путей. и нацеливание сигнальных комплексов на определенные субклеточные сайты.

    Этот подход к конструированию сигнальных путей имеет свои собственные потенциальные трудности. Сигнальные события должны организовывать все сложное поведение клетки, и это должно быть достигнуто с помощью, по-видимому, небольшого количества основных сигнальных путей, построенных на ограниченную группу белковых модулей. Это сразу предполагает, что домены взаимодействия и сигнальные пути должны иметь множественные биологические функции.Таким образом, хотя домены PTB, PDZ и Sh4, например, играют важную роль в тирозинкиназе передачи сигналов, они также важны для совершенно разных процессов, таких как установление клеточной полярности и асимметричности. деление клеток. Во время развития клетки должны часто делиться асимметрично, так что две дочерние клетки по своей сути отличаются друг от друга, как для создания поляризованных тканей, так и для того, чтобы одна стволовая клетка могла генерировать несколько различных типов зрелых клеток.Обычно это достигается за счет регуляторных белков, которые сами становятся асимметричными. локализуются во время митоза и предпочтительно доставляются в одну из образующихся клеток, где организуют ее полярность и судьба. Работа с C. elegans, дрозофилой и млекопитающими установила, что белок, названный PAR-3 (базука у мух и ASIP / PHIP у позвоночных), играет организующую роль. роль в таких процессах (Etemad-Moghadam et al. 1995; Tabuse et al.1998; Lin et al. 1999; Schober et al. 1999; Wodarz et al. 1999). PAR-3 имеет три домена PDZ и карбокси-концевую область, которая взаимодействует с атипичными изоформами PKC и, следовательно, может выполняют функцию каркаса в установлении клеточной асимметрии. В стволовой клетке дрозофилы, клетке-предшественнике сенсорного органа, PAR-3 / Bazooka генетически находится выше других модульных белков, включая Numb (Рю и др., 1994). Numb имеет амино-концевой домен PTB, который, в отличие от доменов PTB Shc и IRS-1, не требует pTyr для пептида. распознавание и довольно гибкие в своих связывающих свойствах (Li et al.1998), и определяет судьбу нейрональных клеток путем ингибирования передачи сигналов через путь Notch (Frize et al. 1996). Данные такого рода установили, что асимметричное деление клеток, осуществляемое в ответ на внутренние сигналы, контролируется. модульными белками с доменами взаимодействия, очень похожими на те, которые используются в сигнальных путях, которые отвечают на внешние стимулы. Таким образом, ячейка частично решила проблему сложности за счет использования тонких вариантов одних и тех же доменов для регулирования широкого спектра внутриклеточных процессов.

    Регулирование интенсивности сигнальных путей

    Одним из способов, которым клетка может использовать одни и те же сигнальные пути для управления широким спектром клеточных процессов, является изменение амплитуда и продолжительность, с которой активируется путь, и преобразовать это в качественно различные биологические реакции.В соответствии с этой возможностью клетка, по-видимому, прилагает значительные усилия для производства белков, которые действуют как регуляторы. сигнальных путей. Они могут действовать просто, чтобы прекратить передачу сигналов, но также могут иметь более специфические эффекты на нисходящий поток. сигнализация. Один из недавних примеров, который также демонстрирует универсальность модулей взаимодействия, включает продукт ген болезни человека Sh3D1A, названный SAP (Sayos et al.1998). Мутации в Sh3D1A вызывают необычный иммунодефицит в результате неспособности контролировать эффекты инфекции вирусом Эпштейна-Барра (EBV). (Кляйн и Кляйн 1998). Белок SAP состоит из одного домена Sh3 всего с несколькими фланкирующими остатками, который связывает костимулирующие рецепторы. в Т-клетках, называемых SLAM и 2B4. В отличие от всех других доменов Sh3, SAP распознает не только фосфотирозин в контексте карбоксиконцевого остатков, но также включает три амино-концевых остатка по отношению к pTyr (Li et al.1999; Poy et al. 1999). Как следствие, SAP может связываться с относительно высоким сродством с нефосфорилированными мотивами на основе Tyr, хотя сродство увеличивается примерно в пять раз при фосфорилировании лиганда. Эти данные предполагают, что SAP может модулировать передачу сигналов другими белками Sh3, либо занимая потенциальное фосфорилирование и блокируя его модификацию, либо связываясь с очень высоким сродством с фосфорилированный сайт и предотвращение доступа к сигнальным белкам Sh3, таким как тирозинфосфатаза Shp2.SAP не появляется играть центральную роль в развитии или функционировании Т-клеток; однако в его отсутствие В-клетки, инфицированные ВЭБ, вызывают несоответствующий ответ цитотоксических Т-лимфоцитов. Таким образом, хотя влияние SAP на функцию Т-лимфоцитов незначительно, оно имеет достаточно важное значение. необходимы для выживания людей, инфицированных ВЭБ.

    Аналогичным образом тирозинкиназы привлекают множество ингибирующих белков Sh3.К ним относятся протеин-убиквитинлигаза E3. c-Cbl и члены семейства регуляторов Cis / SOCS. Экспрессия белков SOCS индуцируется Stat-опосредованной передачей сигналов цитокинов, и они, в свою очередь, связывают рецепторы цитокинов и связанные с ними тирозинкиназы JAK и подавляют передачу сигнала (Starr et al. 1997; Starr and Hilton 1999). На своем карбоксильном конце они обладают доменом, называемым SOCS-боксом, с мотивами, которые связывают белок элонгин B и С.Блок SOCS может быть аналогичен домену F-бокса, описанному выше, в то время как элонгин C связан с адаптером Skp1 СКФ комплекс. Следовательно, белки SOCS могут образовывать комплексы, подобные SCF, которые нацелены на связанные полипептиды для разрушения. (Чжан и др., 1999). Мы коснулись здесь некоторых регуляторов передачи сигналов тирозинкиназы, но очевидно, что аналогичные регуляторы влияют на передача сигналов другими путями (Zeng et al.2000).

    Выводы

    Завершение последовательностей генома дает полный набор белков, которые может производить организм. Как мы понимаем больше о механизмы, посредством которых собираются сигнальные пути, и молекулярная инфраструктура, которая организует клеточное поведение, мы можем подумать о том, чтобы определить полную схему подключения ячейки и использовать эту информацию для лечения многих заболевания, возникающие в результате сбоев в сигнальном процессе.

    Благодарности

    Мы благодарим Джеральда Гиша за подготовку рисунка 1.


    S.
    номер
    Имя базы данных Общее количество взаимодействий
    (на сегодняшний день)
    Ссылки Ссылка на источник Количество видов / организмов

    1 BioGrid 7,17,604 [70] http://thebiogrid.org/ 60

    18 901 DIP 33,135
    76570 [36] http: // dip.doe-mbi.ucla.edu/dip/Main.cgi 637
    3 HitPredict 2,39,584 [71] http://hintdb.hgc.jp/htp42/ 9
    4 MINT 2,41,458 [72] http://mint.bio.uniroma2.it/mint/ 30
    5 IntAct 4 [73] http://www.ebi.ac.uk/intact/ 8
    6 APID 3,22,579 [74] http: // bioinfow .dep.usal.es/apid/index.htm 15
    7 BIND > 3,00,000 [75] http://bind.ca/ -
    8 PINA2.0 3,00,155 [76] http://cbg.garvan.unsw.edu.au/pina/ 7